[發明專利]一種鐵皮石斛多糖及其制備方法

在審

• 申請號: 202011175303.9
• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112250772A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發明（設計）人: 田芳;張艷梅;張翼鑠
• 申請（專利權）人: 云南金九地生物科技有限公司
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;A61P39/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種鐵皮石斛多糖及其制備方法，包括鐵皮石斛根部，其特征在于：所述的一種鐵皮石斛多糖及其制備方法包括以下步驟：

步驟一：提取多糖，采用水提醇沉法從鐵皮石斛根莖中提取粗多糖，結合反復凍融、H2O2脫色、超濾、透析等分離純化方法,分別得到兩種分子量均一的鐵皮石斛多糖DOP-1和DOP-2；

步驟二：物質分析，采用苯酚-硫酸法測得DOP-1和DOP-2的糖含量分別為99.47％、97.46％，高效凝膠滲透色譜法測得兩種多糖的分子量分別為4.929×105Da、3.339×104Da，通過紫外光譜定性掃描以及蛋白質含量定量檢測,發現兩種鐵皮石斛多糖基本不含核酸和蛋白質，間羥基聯苯法確定DOP-1和DOP-2均不含糖醛酸，采用Folin–Ciocalteu法對鐵皮石斛多糖的總酚含量進行測定,結果表明DOP-1和DOP-2的總酚含量分別為147.25mg/kg、918.67mg/kg，通過對兩種多糖的純度鑒定可知,DOP-1和DOP-2成分均一,純度高,滿足對多糖類物質結構鑒定的要求；

步驟三：結構單元測定，單糖組成結果表明兩種多糖均含有葡萄糖和甘露糖,組成比分別為1.00:1.38、1.00:4.06，高碘酸氧化-Smith降解法的分析結果表明兩種多糖末端連接或1.6-連接的糖殘基類型含量較低,主要由氧化降解為赤蘚醇的1.4-連接或1.4.6-連接的糖殘基組成，甲基化分析結果表明,DOP-1的主要連接類型為1,4-連接的葡萄糖和1.4-連接的甘露糖,糖殘基比例為1.00:1.78；DOP-2主要由1.4-連接的葡萄糖、1.4-連接的甘露糖和1.6-連接的葡萄糖組成,糖殘基比例為1.90:14.10:1.00，結合紅外掃描圖譜、Smith降解GC結果以及NMR圖譜的結果進行分析,表明兩種多糖的乙酰基均連在1.4-β-D-Manp的2位或3位,DOP-1和DOP-2的乙酰化比例分別約為50％、30％，由于DOP-2分子量較小,溶解度高,粘度相對DOP-1低,其2D核磁檢測相關峰響應較好,可通過1D和2D NMR圖譜對DOP-2的結構進一步確定,并推測出DOP-2的重復結構單元；

步驟四：體外抗氧活化性測定，體外抗氧化活性的測定采用了三個抗氧化體系,包括DPPH自由基清除體系、羥基自由基清除體系和超氧陰離子自由基清除體系，結果表明,DOP-1和DOP-2對三種自由基均具有較高的體外抗氧化能力,DOP-2的羥基自由基和超氧陰離子自由基清除能力高于DOP-1,可能與其分子量較低、溶解度較高、甘露糖含量較高、乙酰化程度較低以及多酚含量較高有關，此外,選用H2O2建立氧化損傷細胞模型,研究鐵皮石斛多糖DOP-1和DOP-2對氧化損傷Hep G2細胞存活率的影響，結果表明,DOP-1和DOP-2對氧化損傷Hep G2細胞均有一定的保護作用,在濃度為800μg/m L時,細胞存活率均達到90％以上，同時,DOP-1和DOP-2均能夠降低氧化損傷Hep G2細胞內活性氧的強度；

步驟五：組合制備，將上述步驟完成后，將DOP-1和DOP-2進行粉碎，隨后加入約220度的水進行浸泡并加熱，當DOP-1和DOP-2出現分散情況后停止加熱，將其中殘渣進行過濾，提取濃縮液；

步驟六：沉淀干燥，完成步驟五后將濃縮液采用水提醇沉法去除上面漂浮的清液，隨后在高溫下進行沉淀干燥，最終得到鐵皮石斛多糖。

2.如權利要求1所述的一種鐵皮石斛多糖及其制備方法，其特征在于：所述水提醇沉法系指在中藥水提濃縮液中，加入乙醇使達不同含醇量，某些藥物成分在醇溶液中溶解度降低析出沉淀，固液分離后使水提液得以精制的方法，一般操作過程是：將中藥水提液濃縮至1︰1～1︰2(ml︰g)，藥液放冷后，邊攪拌邊緩慢加入乙醇使達規定含醇量，密閉冷藏24～48h，濾過，濾液回收乙醇，得到精制液，操作時應注意以下問題：

①藥液應適當濃縮，以減少乙醇用量，但應控制濃縮程度，若過濃，有效成分易包裹于沉淀中而造成損失；

②濃縮的藥液冷卻后方可加入乙醇，以免乙醇受熱揮發損失；

③選擇適宜的醇沉濃度，一般藥液中含醇量達50％～60％可除去淀粉等雜質，含醇量達75％以上大部分雜質均可沉淀除去；

④慢加快攪，應快速攪動藥液，緩緩加入乙醇，以避免局部醇濃度過高造成有效成分被包裹損失；

⑤密閉冷藏，可防止乙醇揮發，促進析出沉淀的沉降，便于濾過操作；

⑥洗滌沉淀，沉淀采用乙醇(濃度與藥液中的乙醇濃度相同)洗滌可減少有效成分在沉淀中的包裹損失。