[發明專利]一種斑馬魚心衰模型的構建及檢測方法

在審

• 申請號: 202011175134.9
• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112271000A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 史興娟;張俞
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G16H70/40
• 分類號: G16H70/40;G16H50/50;G16B25/20
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 王依

1.一種斑馬魚心衰模型的構建，其特征在于，cmlc2:GFP轉基因斑馬魚將綠色熒光蛋白報告基因偶聯在cmlc2啟動子下游，使其在熒光顯微鏡下可觀察到帶綠色熒光的斑馬魚心臟；nppb:luc轉基因斑馬魚將luciferase報告基因偶聯在nppb啟動子下游，通過luciferase數值來標識nppb的表達水平，用AA處理nppb:luc或cmlc2:GFP兩種轉基因的斑馬魚胚胎，致其心衰標志基因nppb表達量升高，干擾斑馬魚的心臟發育并降低其存活率，從而構建斑馬魚心衰模型，模型的構建方法：

S1、斑馬魚發育階段的確定；

S2、藥物處理：將微孔板設為兩個實驗組分別為藥物處理組和對照組；

S3、采用斑馬魚心肌病模型進行心衰分析；

S4、分析斑馬魚心臟發育；

S5、分析斑馬魚的存活率。

2.根據權利要求1所述的一種斑馬魚心衰模型的構建，其特征在于，所述步驟S1中分別取nppb:luc或cmlc2:GFP品系轉基因斑馬魚的親本交配、孵化，選擇發育24hpf的斑馬魚分別移入到對應的微孔板中，并標記區分。

3.根據權利要求1所述的一種斑馬魚心衰模型的構建，其特征在于，所述藥物處理組是用DMSO溶液溶解AA粉末，配制成10mM AA儲存濃度，取1μL 10mM AA加入到含有1mL魚水的斑馬魚微孔板中，對斑馬魚進行藥物處理，此時藥物AA的處理濃度為10μM。

4.根據權利要求1所述的一種斑馬魚心衰模型的構建，其特征在于，所述對照組是用與藥物處理組同等濃度的DMSO溶液處理斑馬魚胚胎。

5.根據權利要求1所述的一種斑馬魚心衰模型的構建，其特征在于，所述藥物處理組和對照組均加入相同體積的養魚用水，在相同溫度下恒溫培養。

6.根據權利要求1所述的一種斑馬魚心衰模型的構建，其特征在于，所述步驟S3的心衰分析是藥物處理nppb:luc品系斑馬魚至72hpf后，向微孔板的每個孔內加入熒光素酶試劑，避光孵育，對熒光素酶的值進行測定，觀察心衰標志基因nppb的表達水平。

7.根據權利要求1所述的一種斑馬魚心衰模型的構建，其特征在于，所述步驟S4分析心臟發育是對藥物處理cmlc2:GFP品系斑馬魚至72hpf后，將斑馬魚麻醉后，置于熒光顯微鏡下觀察斑馬魚的心臟形態。

8.根據權利要求1所述的一種斑馬魚心衰模型的構建，其特征在于，所述步驟S5分析存活率是對藥物處理cmlc2:GFP品系斑馬魚至96hpf后，在顯微鏡下觀察斑馬魚的心跳，統計斑馬魚的存活率。

9.根據權利要求1-8任意一項所述的一種斑馬魚心衰模型的構建的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法：

T1、藥物處理cmlc2:GFP品系斑馬魚至72hpf后，分離斑馬魚心臟；

T2、提取RNA，反轉錄為cDNA后，進行熒光定量PCR，檢測心衰標志基因nppa、nppb和IL-1β的mRNA的表達水平。