[發明專利]一種斑馬魚心衰模型的構建及檢測方法

在審

• 申請號: 202011175134.9
• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112271000A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 史興娟;張俞
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G16H70/40
• 分類號: G16H70/40;G16H50/50;G16B25/20
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 王依

本發明公開一種斑馬魚心衰模型的構建及檢測方法，cmlc2:GFP轉基因斑馬魚將綠色熒光蛋白報告基因偶聯在cmlc2啟動子下游，使其在熒光顯微鏡下可觀察到帶綠色熒光的斑馬魚心臟；nppb:luc轉基因斑馬魚將luciferase報告基因偶聯在nppb啟動子下游，通過luciferase數值來標識nppb的表達水平，用AA處理nppb:luc或cmlc2:GFP兩種轉基因的斑馬魚胚胎，致其心衰標志基因nppb表達量升高，干擾斑馬魚的心臟發育并降低其存活率，從而構建斑馬魚心衰模型。本發明構建的模型在斑馬魚受精后72小時誘導斑馬魚心衰，同時在斑馬魚動物水平以及組織水平上進行心臟發育和心衰標志基因的表達分析，能快速完成心衰模型的構建及分析；穩定性高、重復性好，可應用于高通量藥物篩選及分析。

技術領域

本發明涉及醫藥領域，具體是一種斑馬魚心衰模型的構建及檢測方法。

背景技術

斑馬魚是一種重要的脊椎動物模式生物，斑馬魚胚胎透明，發育速度快。斑馬魚與人類基因的相似度高，具有與哺乳動物相似的心血管系統、神經系統及代謝系統等。與傳統的模式生物相比，斑馬魚在心血管疾病中有其獨特的優勢，斑馬魚體外受精，體外發育，心臟發育速度快。斑馬魚胚胎在受精后24小時(24hpf)心臟開始跳動，受精后48小時(48hpf)完成心臟環化，形成了S型的心臟，受精后72小時(72hpf)心臟腔室分化完成。在斑馬魚活體胚胎中可以檢測心臟形態與功能的異常。野生型的斑馬魚胚胎暴露于小分子化合物下，與人類的毒性反應具有高度的相關性，在藥物毒性研究方面發揮了重要的作用。

馬兜鈴酸(aristolochic acid，AA)，別名馬兜鈴總酸、增噬力酸,是天然產物中發現的一類硝基菲類有機酸，具有廣泛的藥理作用，如增強細胞免疫、抗腫瘤、抗菌、抗血小板聚集等。含馬兜鈴酸的中草藥達數十種，如關木通、天仙藤、廣防己、青木香、細辛等。研究報道馬兜鈴酸具有明確的腎毒性，還可能是誘發肝癌的重要因素。因此，很多國家對含馬兜鈴酸藥物的使用都有嚴格的規定。本申請用馬兜鈴酸處理nppb:luc和cmlc2:GFP斑馬魚胚胎，導致心衰標志基因nppb的表達量升高，干擾斑馬魚的心臟發育并降低其存活率，從而建立斑馬魚心衰模型。本發明所建立的模型高效、可靠、簡便，在斑馬魚受精后3天即可完成心衰模型的建立及分析，適用于高通量藥物篩選，對于尋找心肌保護或心臟毒性相關藥物具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種斑馬魚心衰模型的構建及檢測方法，通過用AA處理nppb:luc或cmlc2:GFP兩種轉基因的斑馬魚胚胎，致其心衰標志基因nppb表達量升高，干擾斑馬魚的心臟發育并降低其存活率，從而構建斑馬魚心衰模型，構建的模型在斑馬魚受精后72小時誘導斑馬魚心衰，同時在斑馬魚動物水平以及組織水平上進行心臟發育和心衰標志基因的表達分析，能快速完成心衰模型的構建及分析；穩定性高、重復性好，可應用于高通量藥物篩選及分析。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

一種斑馬魚心衰模型的構建，cmlc2:GFP轉基因斑馬魚將綠色熒光蛋白報告基因偶聯在cmlc2啟動子下游，使其在熒光顯微鏡下可觀察到帶綠色熒光的斑馬魚心臟；nppb:luc轉基因斑馬魚將luciferase報告基因偶聯在nppb啟動子下游，通過luciferase數值來標識nppb的表達水平，用AA處理nppb:luc或cmlc2:GFP兩種轉基因的斑馬魚胚胎，致其心衰標志基因nppb表達量升高，干擾斑馬魚的心臟發育并降低其存活率，從而構建斑馬魚心衰模型，模型的構建方法：

S1、斑馬魚發育階段的確定；

S2、藥物處理：將微孔板設為兩個實驗組分別為藥物處理組和對照組；

S3、采用斑馬魚心肌病模型進行心衰分析；

S4、分析斑馬魚心臟發育；

S5、分析斑馬魚的存活率。