[發(fā)明專利]用于敲低PD1基因表達的microRNA及其嵌合抗原受體-T/NK細胞的構(gòu)建

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011173416.5
• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112239759A
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高基民;魏成;趙愛;尹曉光;聶代邦;段德明;龍婧;熊華強
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶斯德姆生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N7/01;C12N5/10;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 重慶千石專利代理事務所(普通合伙) 50259
• 代理人: 冷奇峰

本發(fā)明公開了用于高效敲低PD1基因表達的microRNA及其嵌合抗原受體?T/NK細胞的構(gòu)建，所述microRNA由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列編碼而成，同時將編碼microRNA的核苷酸序列插入于EF1α啟動子內(nèi)，以致不會顯著降低慢病毒載體的包裝效率。本發(fā)明得到的CAR?T/NK細胞內(nèi)PD1基因敲低，且基因敲低效率高，可以實現(xiàn)85％以上的敲低率，有效抑制PD1?PDL1/2通路誘發(fā)的免疫細胞耗竭凋亡，從而提高CAR?T/NK療法的療效，具有良好的應用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于高效敲低PD1基因表達的microRNA及其嵌合抗原受體-T/NK細胞的構(gòu)建。

背景技術(shù)

CAR-T/NK療法是一種以嵌合型抗原受體為基礎(chǔ)的細胞免疫治療方案。通過體外基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將編碼嵌合抗原受體(CAR)的基因序列轉(zhuǎn)導入T/NK細胞中，生成可以結(jié)合靶抗原的腫瘤特異性T/NK細胞。近幾年，CART細胞免疫治療在血液腫瘤的臨床前和臨床試驗中表現(xiàn)出巨大的潛力，但由于腫瘤微環(huán)境中免疫檢查點的抑制作用，CART細胞在實體瘤治療中的效果一直不盡如人意。

PD-1(程序性死亡受體)是一種表達于T細胞表面的蛋白質(zhì)分子，當PD-1與其配體PD-L1或PD-L2結(jié)合時可抑制下游NF-κB基因的轉(zhuǎn)錄，抑制干擾素-γ的分泌，從而抑制T細胞的殺傷活性。其中PD-1/PD-L1通路已經(jīng)被證實與T細胞耗竭有關(guān)，會導致CART細胞功能減退，腫瘤清除能力受損等問題。采用PD-1抗體或PD-L1抗體阻斷PD-1與PD-L1、PD-L2的結(jié)合，可使T細胞的腫瘤殺傷活性不受抑制，從而提高T細胞殺腫瘤的效果。

為了解決上述問題，發(fā)明專利201711196439.6公開了一種敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受體T細胞及其制備方法和應用，采用CRISPR/Cas9敲除CART細胞PD-1，雖然該方法表現(xiàn)出了高效抗腫瘤效果，然而也有研究發(fā)現(xiàn)在初始CD8+T細胞中程序性細胞死亡因子1基因(PDCD1)的意外缺失會增加其耗竭并損傷細胞的存活性和功能，并且基因敲除會對其它基因產(chǎn)生不可預期的破壞和影響。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、通過抑制mRNA翻譯或使mRNA高效特異性降解從而介導轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象。由dsRNA介導的基因沉默過程通常需要經(jīng)過三個步驟來實現(xiàn)。首先是dsRNA進入細胞后與酶蛋白Dicer結(jié)合并被Dicer切割成21-23nt長的小片段，這些小片段被稱為siRNA；緊接著siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)；最后被激活的RISC在反義鏈的引導下與目標mRNA結(jié)合，通過抑制mRNA的翻譯或使mRNA降解介導轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。所以基因沉默是一種能降低目的基因表達的分子機制，它不像基因敲除會消除整個目的基因的表達，只會使靶基因的表達降低至少70％。與傳統(tǒng)的基因敲除手段相比，RNAi技術(shù)具有快速、高效、特異性強、操作簡易等優(yōu)點，近年來已經(jīng)成為揭示不同物種中基因功能的工具，被廣泛應用于植物、線蟲、果蠅及哺乳動物。所以我們假設(shè)，如果使用siRNA的方式使CART細胞中的PD-1表達降低，這樣T/NK細胞不僅能躲避腫瘤微環(huán)境中的抑制信號，并且還避免完全敲除PD1基因帶來的損害和且存在脫靶風險。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：如何提供一種用于敲低PD1基因表達的microRNA及其嵌合抗原受體-T/NK細胞的構(gòu)建，解決腫瘤細胞存在逃逸問題及基因敲除存在脫靶風險的問題。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：一種用于高效敲低PD1基因表達的microRNA，所述microRNA由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列編碼而成。