[發(fā)明專利]用于檢測尼卡巴嗪的熒光偏振免疫分析方法和應用

在審

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• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112305219A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設計）人: 梁曉;張啟迪;李金燕;于萬鵬;王婉瑜
• 申請（專利權）人: 青島農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 劉楊

本發(fā)明提供一種用于檢測尼卡巴嗪的熒光偏振免疫分析方法和應用，通過尼卡巴嗪半抗原與多種異硫氰酸熒光素偶聯(lián)得到多種熒光標記物，得到最佳的熒光標記物和抗體組合。建立了雞肉中尼卡巴嗪殘留熒光偏振免疫分析方法。本發(fā)明建立的尼卡巴嗪標準曲線，方法的IC50為28.3ng/mL，線性檢測范圍為10.3～78.1ng/mL，且與其他抗球蟲藥無明顯交叉，特異性好。將其應用于雞肉中尼卡巴嗪的檢測，LOD為24.2μg/kg，回收率為74.2％～85.8％，變異系數(shù)為4.0％～8.6％。該方法的靈敏度、回收率及精密度達到檢測的要求。本發(fā)明建立的方法操作簡單、效率高、短時間即可完成檢測，對于現(xiàn)NIC在動物性食品中殘留快速篩選檢測以及在畜禽生產(chǎn)中的規(guī)范使用具有重要意義。

技術領域

本發(fā)明屬于獸藥殘留檢測技術領域，具體涉及到一種用于檢測尼卡巴嗪的熒光偏振免疫分析方法和應用。

背景技術

雞肉是我國除豬肉之外的第二大肉類產(chǎn)品，而球蟲病是禽類養(yǎng)殖業(yè)常見且危害嚴重的一種寄生蟲病。尼卡巴嗪(nicarbazin，NIC)是一種良好的預防雞球蟲病的藥物，廣泛用于雞和火雞球蟲病的防治，是由4,4’-二硝基苯脲(4,4-Dinitrocarbanilide，DNC)和2-羥基-4,6-二甲基嘧啶(2-hydroxyl4,6-dimethylpyrimidine，HDP)組成的等分子復合物，其中，DNC為殘留標志物。雖然其毒性較低，但也發(fā)現(xiàn)存在一定的毒性。目前，關于NIC生理毒性的研究顯示，當長期攝入正常劑量的80倍后，雄鼠精子畸變率明顯增加。NIC對產(chǎn)蛋母雞的繁殖性能也有一定的影響，所以臨床上禁止將尼卡巴嗪用于產(chǎn)蛋雞。長期食用尼卡巴嗪殘留超標的雞肉，會對人體健康存在潛在的風險。近年來，我國農(nóng)業(yè)部獸藥殘留監(jiān)控檢測數(shù)據(jù)表明，在所有必檢藥物中NIC是唯一超標的抗球蟲藥，且其被檢測到的陽性率逐年有上升趨勢，因此對雞肉及其它禽類副產(chǎn)品中NIC殘留檢測十分有必要。

目前針對NIC殘留檢測的方法主要有儀器分析方法和免疫分析檢測方法，儀器分析方法結果準確，具有高度選擇性和快速高效等優(yōu)點，但是儀器方法也有設備昂貴、耗時長，不適于基層現(xiàn)場監(jiān)控及大規(guī)模快速篩查等不足。免疫分析方法是除儀器方法外最常見的檢測方法，是以抗原、抗體特異性結合為基本特征的快速檢測分析技術，因其特異性強、時間短、靈敏度高、成本低、通量高等特點可應用于飼料生產(chǎn)、養(yǎng)殖、畜禽產(chǎn)品流通及銷售等各個環(huán)節(jié)，目前普遍應用于動物性食品中藥物殘留快速檢測中。如受到國際廣泛關注的β-興奮劑類、磺胺類、氯霉素、氨基糖苷類、喹諾酮類等藥物都已建立了免疫分析快速檢測方法。然而，迄今為止，國內外采用免疫分析方法對NIC在動物性食品中的殘留分析方法報導很少，難以滿足實際樣本篩查NIC的檢測需求。

目前，檢測NIC殘留的主要免疫方法主要包括酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)、免疫測流層析方法、表面等離子體共振(SPR)等。其中基于ELISA檢測方法的文獻報道居多，ELISA方法為固相的免疫分析方法，檢測過程中需要多次分離和洗滌步驟，耗時較長，整個反應步驟需1.5h，甚至長達2h方可完成。

因此，建立一種快速、靈敏、簡便的NIC殘留檢測方法，勢在必行。對于我國實現(xiàn)NIC在動物性食品中殘留快速篩選檢測以及在畜禽生產(chǎn)中的規(guī)范使用具有重要意義。

發(fā)明內容

本發(fā)明針對上述現(xiàn)有檢測NIC免疫技術操作復雜、耗時長等缺點，建立一種用于檢測尼卡巴嗪的熒光偏振免疫分析方法，整個過程只需要一步競爭反應，操作簡單、快速。

基于上述目的，本發(fā)明提供一種用于檢測尼卡巴嗪的熒光偏振免疫分析方法，是將待測樣品與熒光標記物溶液及尼卡巴嗪單克隆抗體溶液混合，孵育進行競爭反應，測定所得體系的熒光偏振值，根據(jù)熒光偏振值-尼卡巴嗪標準樣品中尼卡巴嗪濃度標準曲線，計算所述待測樣品中尼卡巴嗪的濃度。

具體地，包括以下步驟：

S1、將一系列已知濃度的尼卡巴嗪標準品的溶液分別與熒光標記物溶液以及尼卡巴嗪單克隆抗體溶液混合，孵育進行競爭反應，測定所得體系的熒光偏振值；