[發明專利]一種基于COI基因序列的多鱗四指馬鲅和四指馬鲅的分子鑒別方法

在審

• 申請號: 202011167259.7
• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112159851A
• 公開（公告）日: 2021-01-01
• 發明（設計）人: 鐘立強;王明華;陳校輝;李大命;唐晟凱;劉燕山
• 申請（專利權）人: 江蘇省淡水水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 徐激波

本發明公開了一種基于COI基因序列的多鱗四指馬鲅和四指馬鲅的分子鑒別方法，步驟包括：1)分別提取多鱗四指馬鲅和四指馬鲅基因組DNA；2)利用上游引物和下游引物PCR擴增多鱗四指馬鲅和四指馬鲅的細胞色素氧化酶亞基I基因，得到目的片段的PCR產物；3)擴增產物純化后，直接測序，對多鱗四指馬鲅和四指馬鲅擴增產物序列比對，序列的第356?357位點堿基為AA的是多鱗四指馬鲅，序列的第356?357位點堿基為GG的則是四指馬鲅。該方法能快速、簡便、準確、有效地鑒別多鱗四指馬鲅和四指馬鲅，結果穩定，重復率高，將在水產養殖和漁業資源調查中發揮重要作用。

技術領域

本項發明屬于遺傳學領域，涉及一種基于COI基因序列的多鱗四指馬鲅和四指馬鲅的分子鑒別方法。

背景技術

多鱗四指馬鲅(Eleutheronema rhadinum)和四指馬鲅(E.tetradactylum)隸屬于鯔形目馬鲅科四指馬鲅屬，俗稱午魚、馬友，其脂肪含量高，肉質細嫩，蛋白質豐富，具有較高的食用價值和經濟價值，是名貴的高端海水魚類。在我國，四指馬鲅的人工繁育和養殖剛剛有所進展，商品魚主要還是來源于捕撈。但是，隨著需求的日益增加，多鱗四指馬鲅和四指馬鲅的自然資源日趨衰竭，開展資源的保護工作迫在眉睫。

馬鲅科的魚類外形相似、鑒別特征不顯著、容易混淆，形態分類學上主要是依據胸鰭下方的游離絲狀鰭條數進行區別，如三指馬鲅、四指馬鲅、六指馬鲅等。而多鱗四指馬鲅和四指馬鲅同屬于四指馬鲅屬，胸鰭下方均具4根游離絲狀鰭條，除胸鰭顏色、側線鱗數目和犁骨齒板不同外，其他形態學特征幾乎相同，多鱗四指馬鲅常被誤認為是同四指馬鲅的幼魚。兩種魚類不僅形態上非常相似，生境也相似，經常混棲于相同水域，體型很小的仔稚魚就更難辨認，給資源的保護和管理帶來了一定難度。因此，急需一種快捷方便、準確可靠的多鱗四指馬鲅和四指馬鲅鑒別方法。

發明內容

針對現有技術中的不足，本發明提供一種基于COI基因序列的多鱗四指馬鲅和四指馬鲅的分子鑒別方法，通過設計引物對進行鑒定。

作為本發明的一個方面，本發明提供一種基于COI基因序列的多鱗四指馬鲅和四指馬鲅的分子鑒別方法，其包含以下步驟，(1)分別提取待鑒定的多鱗四指馬鲅和四指馬鲅基因組DNA；(2)以提取的基因組DNA為模板，PCR擴增多鱗四指馬鲅和四指馬鲅的細胞色素氧化酶亞基I基因，PCR擴增使用的上游引物如序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3，下游引物如序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4；(3)擴增產物純化后，直接測序，進行多鱗四指馬鲅和四指馬鲅擴增產物序列比對，序列的第356-357位點堿基為AA的是多鱗四指馬鲅，序列的第356-357位點堿基為GG的則是四指馬鲅。

優選的，所述的PCR反應體系為50μL：50ng/μL的模板DNA 1μL，PCR緩沖液5μL，dNTP混合液4μL，每種dNTP 0.1mmol/L，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2μL 2IU的Taq酶；雙蒸水36μL；所述的PCR緩沖液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl₂，0.01％明膠組成；PCR擴增反應程序為：94℃預變性2min，94℃變性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min，經35個循環后再72℃延伸10min。

作為本發明的另一個方面，本發明提供一種基于COI基因序列的多鱗四指馬鲅和四指馬鲅分子鑒別的引物對，其包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列為SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.3，所述下游引物的序列為SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4。

作為本發明的另一個方面，本發明提供一種上述引物對在制備多鱗四指馬鲅和四指馬鲅分子鑒別試劑中的應用。