[發明專利]一種海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法及應用

在審

• 申請號: 202011162933.2
• 申請日: 2020-10-27
• 公開（公告）號: CN112322691A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 黃日明;劉致遠;胡蓮美;張曉勇;徐振林;雷紅濤
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;A23L33/125
• 代理公司: 廣州文智專利代理事務所(特殊普通合伙) 44469
• 代理人: 張濤

本發明涉及生物化學技術領域，公開了一種海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法及應用。本發明通過UPLC?MS/MS方法檢測出海藻多糖處理后的巨噬細胞中一種特征代謝物?瓜氨酸，將其作為快速篩選海藻多糖的免疫調節活性的生物標志物，根據其差異代謝情況篩選海藻多糖的免疫調節活性，并驗證了總狀蕨藻盾葉變種多糖、裙帶菜多糖及孔石莼多糖作用于巨噬細胞的免疫調節活性與瓜氨酸代謝量之間的關聯性。本發明的海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法具有快速高效性、無需大量使用化學或生物試劑、環保清潔、易于推廣應用等優點，可以為縮短海藻多糖來源的免疫功能食品研發周期提供參考依據。

技術領域

本發明涉及生物化學技術領域，更具體的，涉及一種海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法及應用。

背景技術

多糖是所有生命有機體的重要組分，在控制細胞分裂、調節細胞生長以及維持生命有機體正常代謝等方面具有重要作用。而海藻多糖作為一類良好的免疫調節劑，對大多數細胞都沒有明顯毒性，海藻多糖能刺激各種免疫活性細胞(如巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞等)的分化、成熟、繁殖，以及能使機體的免疫系統得到恢復和加強，被公認為是一種重要的生物效應調節劑。

目前海藻多糖體外免疫調節活性的篩選主要是以小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞為研究對象，研究海藻多糖對RAW264.7細胞的毒性作用、吞噬活性的影響，以NO的釋放量為主要指標，篩選免疫活性組分多糖，用ELISA試劑盒法測定巨噬細胞的腫瘤壞死因子TNF-α和細胞因子IL-6、IL-1β的釋放量等生物指標來評評價，但該方法所用儀器較多，實驗步驟繁雜，過程費時且所用試劑盒以及化學或生物溶劑較多，效率低且成本高，不利于海藻多糖研發和應用的快速和廣泛推廣。

代謝物是生物體表型的基礎，能幫助更直觀有效地了解生物學過程及其機理。基于對代謝物的定性定量分析，代謝組學可以用于代謝途徑或代謝網絡的解析，不同生物個體的宏觀表型現象的代謝基礎研究，以及動物經濟性狀育種價值評估、疾病診斷預防、動物產品安全性評價和動物醫學模型應用。

綜上所述，研發一種以細胞代謝物為生物標志物的海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法及其分離培養方法和應用實為必要。

發明內容

本發明所提供的海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法及應用，主要用于解決但該方法所用儀器和試劑較多，實驗步驟繁雜，過程費時，效率低且成本高，不利于海藻多糖研發和應用的快速和廣泛推廣的問題。本發明以巨噬細胞為實驗對象，選取不同來源的海藻多糖對齊進行干預處理，進行代謝組學分析，通過檢測經海藻多糖干預處理后的巨噬細胞的一種特征代謝物-瓜氨酸，由于瓜氨酸是通過巨噬細胞中一氧化氮合酶(NOS)催化精氨酸生成NO的副產物，將其作為快速篩選海藻多糖的免疫調節活性的生物標志物，通過分析海藻多糖作用于巨噬細胞的免疫調節活性與瓜氨酸的關聯性，驗證本發明的海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法的可行性和可靠性。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明提供的一種海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法，包括以下步驟：

S1.細胞樣本處理：取對數生長期的巨噬細胞，置于完全培養液中，計數并調整細胞懸液濃度至2×10⁶個/mL后，接種至無菌培養皿中，每孔加入1mL，37℃培養20～40小時，中間更換一次培養液，棄上清后用PBS緩沖液清洗2～4次，加入濃度為80～100μg/mL的海藻多糖溶液5～8mL，37℃培養15～20小時；

然后將細胞輕輕吹打成懸浮液，進行細胞計數，并將2×10⁷個細胞轉移至離心管中，離心處理后吸出上清液，將收集的細胞用經預冷的PBS緩沖液清洗，并用移液器輕輕吹打，避免劇烈振蕩造成細胞破碎，離心處理后，吸干水分并封口，將細胞樣本置于液氮中速凍后，再置于-80℃低溫保存；