[發明專利]一種海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法及應用

在審

• 申請號: 202011162933.2
• 申請日: 2020-10-27
• 公開（公告）號: CN112322691A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 黃日明;劉致遠;胡蓮美;張曉勇;徐振林;雷紅濤
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;A23L33/125
• 代理公司: 廣州文智專利代理事務所(特殊普通合伙) 44469
• 代理人: 張濤

1.一種海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.細胞樣本處理：取對數生長期的巨噬細胞，置于完全培養液中，調整細胞懸液濃度后，接種至無菌培養皿中，每孔加入1mL，37℃培養20～40小時，棄上清后用PBS緩沖液清洗2～4次，加入濃度為80～100μg/mL的海藻多糖溶液5～8mL，37℃培養15～20小時，然后將細胞吹打成懸浮液，離心處理后吸出上清液，將收集的細胞用經預冷的PBS緩沖液清洗，離心處理，吸干水分并封口，將細胞樣本速凍后，再低溫保存；

S2.樣品提取：取出細胞樣本，解凍后，加入1～3mL經預冷的提取劑，振蕩混勻后，先置于液氮中速凍，然后取出在冰上解凍，再進行離心處理，取上清液待檢；

S3.代謝組學分析：對步驟S2得到的上清液進行代謝組學分析，采用超高效液相色譜和串聯質譜方法檢測采集數據，分析細胞代謝物變化情況；

S4.篩選評價：以海藻多糖處理后的細胞的代謝物中的瓜氨酸作為生物標志物，根據其差異代謝情況篩選海藻多糖的免疫調節活性。

2.根據權利要求1所述的海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法，其特征在于，所述步驟S1中的完全培養液是通過在DMEM培養液中加入10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)雙抗而制得。

3.根據權利要求2所述的海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法，其特征在于，所述步驟S2中的提取劑為70％的甲醇水溶液，其中含1μg/mL的2-氯苯丙氨酸，所述提取劑在使用前的預冷溫度為-20℃。

4.根據權利要求3所述的海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法，其特征在于，所述步驟S1中，清洗收集的細胞所用的PBS緩沖液在使用前需于-20℃條件下進行預冷。

5.根據權利要求4所述的海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法，其特征在于，所述步驟S1和步驟S2中，離心處理的溫度為4℃，離心轉速為1000～12000rpm，離心處理時間為8～12min。

6.根據權利要求5所述的海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法，其特征在于，所述步驟S2中，所述細胞樣本加入提取劑振蕩混勻后，先置于液氮中速凍3min，然后取出在冰上解凍2min，如此循環3次，再進行離心處理。

7.根據權利要求1～6任一項所述的海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法，其特征在于，所述步驟S1中所用的海藻多糖溶液為總狀蕨藻盾葉變種多糖溶液、裙帶菜多糖溶液或者孔石莼多糖溶液中的一種。

8.如權利要求1～7任一項所述的海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法的應用，其特征在于，所述海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法用于篩選和評價海藻多糖的免疫調節活性。

9.根據權利要求8所述的海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法的應用，其特征在于，所述海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法用于篩選和評價總狀蕨藻盾葉變種多糖、裙帶菜多糖或者孔石莼多糖的免疫調節活性。

10.根據權利要求9所述的海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法的應用，其特征在于，所述海藻多糖免疫調節活性的快速篩選方法用于研發海藻多糖來源的免疫功能食品。