[發明專利]一種用于表達角鯊烯合成酶的載體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202011161880.2
• 申請日: 2020-10-27
• 公開（公告）號: CN114480458A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 孫晨皓;宗夜晴
• 申請（專利權）人: 深圳藍晶生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/54;C12N1/21;C12P5/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京金信知識產權代理有限公司 11225
• 代理人: 李雪芹;徐琳

本發明涉及一種用于表達角鯊烯合成酶的載體及其構建方法和應用。所述載體包含強啟動子pTAC控制下的角鯊烯合酶基因hSQS，hSQS基因通過依據參照大腸桿菌密碼子偏好性所優化以提高蛋白表達量。本發明為大腸桿菌發酵生產角鯊烯提供了有效的載體工具。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種用于表達角鯊烯合成酶的載體及其構建方法和應用。

背景技術

角鯊烯(Squalene)，又稱三十碳六烯，是一種不飽和脂肪烯烴。角鯊烯是所有細胞中甾醇的前體，是一種非常重要的功能油脂，具有強攜氧能力、抗氧化、抗輻射、解毒作用、抑制微生物的生長、調控動物體中膽固醇的代謝以及防癌和抗癌作用等重要生理活性，在食品、醫藥、化妝品等領域具有包括以下方面的廣泛應用：①角鯊烯抗氧化、抵御紫外線傷害，可用作化妝品；②角鯊烯可作為藥物緩釋劑，增強藥物的治療效果；③角鯊烯可攝取大量的氧，加強細胞新陳代謝消除疲勞，已成為功能明確的活性成分，在功能性食品中應用廣泛；④角鯊烯是一種良好的自由基清除劑，因其具有抗氧化、降血糖、降血脂等生物活性，可用于保健品的生產加工，如角鯊烯軟膠囊(角鯊烯含量為100-500mg/粒)等；⑤角鯊烯常被添加于大豆油、花生油等食用植物油中，抑制或延緩油脂的氧化，從而提高食用植物油的穩定性，延長產品的貨架期。

通常情況下，角鯊烯大量存在于深海鯊魚肝臟中，本著保護動物、保護環境的理念，研究人員都在積極探索其他角鯊烯來源。此外，海洋動物肝臟中存在的類似化合物，如膽固醇，使角鯊烯純化困難，難以大規模生產應用。角鯊烯也可以從植物來源獲得，但由于含量低，純化條件復雜，難以滿足制藥和工業應用的需求。

由于微生物發酵存在著生長周期短，產量高、培養方法簡單，原料來源豐富，價格低廉，經濟效益高，受環境因素限制小等優點，因而成為目前國際上的一個新研究領域。

角鯊烯的前體物質為法尼基二磷酸酯(FPP)，主要有兩種合成途徑：甲基赤蘚糖-4-磷酸(MEP)途徑和甲羥戊酸(MVA)途徑，其中MEP途徑主要存在于植物、細菌和藻類等，而MVA途徑主要存在于真核生物、古細菌和高等植物的細胞液中。

大腸桿菌不含有角鯊烯合酶基因但具有角鯊烯合成前體物質法尼基焦磷酸合成途徑，更有利于活性驗證及代謝途徑改造，同時大腸桿菌基遺傳背景清楚，易于培養，繁殖速度快，是良好的模式生物。

發明內容

本發明的技術目的是通過構建載體以便在大腸桿菌中引入角鯊烯合成酶基因從而高效生產角鯊烯。

本發明的另一目的是提供通過微生物發酵法生產角鯊烯的方法，其中，所述方法利用上述構建的載體。

一方面，本發明提供一種用于表達角鯊烯合成酶的載體，其含有角鯊烯合成酶基因，特別是優化的角鯊烯合成酶基因(SEQ ID NO：9)。

在具體實施方式中，所述載體含有強啟動子pTAC，以控制角鯊烯合酶基因。

在具體實施方式中，所述載體的序列為SEQ ID NO：8。

另一方面，本發明提供一種上述載體的構建方法，所述方法包括以下步驟：

1).構建重組質粒pTYT，

其中，以質粒載體pET-28b(+)為模板并進行反向PCR獲得線性化載體片段H1，以質粒載體pRG為模板通過PCR獲得片段H2，將H1、H2通過Gibson Assembly方法連接，得到重組質粒pTYT；

2).構建pTYT-hSQS載體，

通過Golden Gate組裝將hSQS片段H3(優選SEQ ID NO：9)與重組質粒pTYT連接，得到重組載體pTYT-hSQS。

在具體實施方式中，在步驟1)中，使用的引物的序列如下：