[發明專利]一種用于表達角鯊烯合成酶的載體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202011161880.2
• 申請日: 2020-10-27
• 公開（公告）號: CN114480458A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 孫晨皓;宗夜晴
• 申請（專利權）人: 深圳藍晶生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/54;C12N1/21;C12P5/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京金信知識產權代理有限公司 11225
• 代理人: 李雪芹;徐琳

1.一種用于表達角鯊烯合成酶的載體，其含有角鯊烯合成酶基因，特別是優化的角鯊烯合成酶基因(SEQ ID NO：9)。

2.根據權利要求1所述的載體，其中，所述載體的序列為SEQ ID NO：8。

3.一種如權利要求1所述的載體的構建方法，所述方法包括以下步驟：

1).構建重組質粒pTYT，

其中，以質粒載體pET-28b(+)為模板并進行反向PCR獲得線性化載體片段H1，以質粒載體pRG為模板通過PCR獲得片段H2，將H1、H2通過Gibson Assembly方法連接，得到重組質粒pTYT；

2).構建pTYT-hSQS載體，

通過Golden Gate組裝將hSQS片段H3(優選SEQ ID NO：9)與重組質粒pTYT連接，得到重組載體pTYT-hSQS。

4.根據權利要求3所述的方法，其中，在步驟1)中，使用的引物的序列如下：

H1-primer 1：SEQ ID NO：1

H1-primer 2：SEQ ID NO：2

H2-primer 1：SEQ ID NO：3

H2-primer 2：SEQ ID NO：4。

5.根據權利要求3所述的方法，其中，在步驟1)中，構建的重組質粒pTYT的序列為SEQID NO：7。

6.一種重組菌，其含有權利要求1所述的用于表達角鯊烯合成酶的載體，優選地，所述重組菌中還轉入了pMevT和pMBIS質粒。

7.一種通過微生物發酵法生產角鯊烯的方法，其中，所述方法利用如權利要求1所述的載體。

8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述微生物為大腸桿菌DH10B。

9.根據權利要求7所述的方法，其中，在所述方法中，當發酵中添加抗生素時，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的濃度為20μM，在不添加抗生素時，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的濃度為100μM。

10.根據權利要求8所述的方法，其中，所述大腸桿菌中還轉入了pMevT和pMBIS質粒。