[發明專利]豬星狀病毒2型TaqMan熒光定量PCR試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202011161785.2
• 申請日: 2020-10-27
• 公開（公告）號: CN112280899A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 劉歡;張文超;劉心
• 申請（專利權）人: 廣西中醫藥大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司 11588
• 代理人: 王希剛

本發明公開了一種豬星狀病毒2型TaqMan熒光定量PCR檢測試劑盒，所述的試劑盒包括檢測豬星狀病毒2型ORF1ab保守基因序列的PCR反應液，所述的PCR反應液包括引物對、TaqMan探針、2×PrimDirect Probe RT?Qpcr Mix with UNG等。所述的試劑盒還包括標準品。本發明還公開了一種所用所述試劑盒檢測豬星狀病毒2型的方法以及該試劑盒在豬星狀病毒2型診斷中的應用。本發明所述的試劑盒特異性好、靈敏度高、重復性好。可以為PAstV2的流行病學調查以及檢測診斷PAstV2提供準確、可靠的技術工具。

技術領域

本發明涉及豬星狀病毒2型TaqMan熒光定量PCR及其應用，屬于生物醫藥領域，具體屬于分子生物學技術領域。

背景技術

星狀病毒是一種無囊膜包被的單股正鏈RNA病毒，其基因組全長約6.4kb～7.3kb。星狀病毒的宿主范圍極廣，可感染人、豬、牛、犬、貓等多種哺乳動物，以及雞、鴨、火雞等禽類動物。豬在感染星狀病毒后常常表現為無癥狀或輕微腹瀉等臨床癥狀，因而被認為是一種腹瀉相關病原。豬星狀病毒目前可分為5個基因型(PAstV1～PAstV5)，遺傳進化分析結果顯示，各基因型可能存在不同的進化祖先。流行病學調查結果顯示，PAstV在我國豬群內的流行率較高，且5個基因型均有發現。因此，建立一種快速、準確的PAstV2實驗室診斷方法，對于了解PAstV2在我國豬群中的流行情況具有重要意義。本發明旨在建立一種可以快速、準確地檢測PAstV2的TaqMan熒光定量PCR方法，并以此為基礎制備試劑盒，為PAstV2的流行病學調查以及檢測診斷PAstV2提供準確、可靠的技術工具。

發明內容

為了彌補現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種快速、準確地檢測PAstV2的TaqMan熒光定量PCR的試劑盒。

因此，本發明一方面提供了一種豬星狀病毒2型TaqMan熒光定量PCR檢測試劑盒，所述的試劑盒包括檢測豬星狀病毒2型ORF1ab保守基因序列的PCR反應液，所述的PCR反應液包括引物對和Taqman探針，所述引物對和TaqMan探針的序列如下：

PAstV2-F：5’-CTGCGCCTACCACCGCGCAGGAGG-3’；

PAstV2-R：5’-CGAGAGTCCTCVAGGAAGTTGTA-3’；

PAstV2-probe：5’-FAM-TACCACCATGTGACCCAGACCTNCCYTTC-3’BHQ1。

優選地，本發明所述的豬星狀病毒2型Taqman探針的核苷酸序列的5’端標記FAM熒光報告基團，3’端標記BHQ1淬滅基團。

優選地，本發明所述的PCR反應液還包括2×PrimDirect Probe RT-Qpcr Mixwith UNG

優選地，本發明所述的試劑盒的反應體系為2×PrimDirect Probe RT-Qpcr Mixwith UNG 12.5μL，PAstV2-F、PAstV2-R各0.5μL，PAstV2-probe 0.5μL，處理后樣本2μL，滅菌水補齊至25μL。

優選地，本發明所述的試劑盒還包括標準品，所述標準品為豬星狀病毒2型陽性樣品cDNA擴增片段回收純化后克隆至pMD18-T中所得，所述標準品濃度為1.4×10⁷copies/μL、1.4×10⁶copies/μL、1.4×10⁵copies/μL、1.4×10⁴copies/μL、1.4×10³copies/μL、1.4×10²copies/μL。

優選地，本發明所述的標準品中目的片段的序列如SEQ ID NO.1所示。