[發明專利]豬星狀病毒2型TaqMan熒光定量PCR試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202011161785.2
• 申請日: 2020-10-27
• 公開（公告）號: CN112280899A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 劉歡;張文超;劉心
• 申請（專利權）人: 廣西中醫藥大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司 11588
• 代理人: 王希剛

1.一種豬星狀病毒2型TaqMan熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括檢測豬星狀病毒2型ORF1ab保守基因序列的PCR反應液，所述的PCR反應液包括引物對和Taqman探針，所述引物對和TaqMan探針的序列如下：

PAstV2-F：5’-CTGCGCCTACCACCGCGCAGGAGG-3’；

PAstV2-R：5’-CGAGAGTCCTCVAGGAAGTTGTA-3’；

PAstV2-probe：5’-FAM-TACCACCATGTGACCCAGACCTNCCYTTC-3’BHQ1。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的豬星狀病毒2型Taqman探針的核苷酸序列的5’端標記FAM熒光報告基團，3’端標記BHQ1淬滅基團。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的PCR反應液還包括2×PrimDirectProbe RT-Qpcr Mix with UNG。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒的反應體系為2×PrimDirect Probe RT-Qpcr Mix with UNG 12.5μL，PAstV2-F、PAstV2-R各0.5μL，PAstV2-probe 0.5μL，處理后樣本2μL，滅菌水補齊至25μL。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括標準品，所述標準品為豬星狀病毒2型陽性樣品cDNA擴增片段回收純化后克隆至pMD18-T中所得，所述標準品濃度為1.4×10⁷copies/μL、1.4×10⁶copies/μL、1.4×10⁵copies/μL、1.4×10⁴copies/μL、1.4×10³copies/μL、1.4×10²copies/μL。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的標準品中目的片段的序列如SEQID NO.1所示。

7.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒的反應條件為：90℃3min，56℃5min，為第一步循環；95℃5s，56℃30s，為第二步40個循環，所述第二步每個循環的延伸結束時進行熒光信號檢測。

8.一種使用權利要求1所述的試劑盒檢測豬星狀病毒2型的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟：

1)樣品處理；

2)將上述步驟所得處理后樣品直接加到試劑盒的反應體系中，進行熒光定量PCR反應，并同時以標準品作為樣品進行熒光定量PCR反應；

3)以標準品Ct值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標做標準曲線，將樣品的Ct值代入標準曲線中計算樣品的拷貝數。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步驟1)中的樣品為糞便。

10.一種如權利要求1所述的豬星狀病毒2型TaqMan熒光定量PCR檢測試劑盒在豬星狀病毒2型診斷中的應用。