[發(fā)明專利]一種鑒定三葉斑潛蠅鈉離子通道基因突變的方法及專用引物

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• 申請日: 2020-10-27
• 公開（公告）號: CN112342299A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳少英;吳建濤;李芬;王顥
• 申請（專利權(quán)）人: 海南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6858;C12N15/11
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本發(fā)明公開了一種鑒定三葉斑潛蠅鈉離子通道基因突變的方法及專用引物，具體是鑒定三葉斑潛蠅擊倒抗性相關(guān)突變位點(diǎn)L1014F和M918T的方法及其專用引物。所述專用引物包含擴(kuò)增引物和測序引物；所述擴(kuò)增引物包含正向引物的核苷酸為LT5F序列和所述反向引物的核苷酸為LT5R序列，所述測序引物同擴(kuò)增引物的反向引物L(fēng)T5R。本發(fā)明利用常規(guī)PCR儀器和二代測序技術(shù)，可檢測出三葉斑潛蠅擊倒抗性相關(guān)突變位點(diǎn)L1014F和M918T，具有實(shí)驗(yàn)操作簡單、檢測結(jié)果準(zhǔn)確直觀的特點(diǎn)，對于三葉斑潛蠅抗性基因突變的篩選和鑒定具有極其重要作用，有助于監(jiān)測三葉斑潛蠅對擬除蟲菊酯類藥劑的抗性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中有關(guān)檢測昆蟲突變基因的頻率，可監(jiān)測對擬菊酯類除蟲藥劑產(chǎn)生抗性水平的相關(guān)技術(shù)，具體是一種鑒定三葉斑潛蠅鈉離子通道基因突變的方法及專用引物，并提供一種鑒定三葉斑潛蠅擊倒抗性相關(guān)突變位點(diǎn)M918T和L1014F的方法及其專用引物。

背景技術(shù)

三葉斑潛蠅(liriomyza trifolii Burgess)屬雙翅目、潛蠅科、斑潛蠅屬，世界上許多國家將它列為重大檢疫性害蟲，是有害觀賞植物、蔬菜及農(nóng)作物的主要害蟲之一，2005年在我國廣東省首次發(fā)現(xiàn)三葉斑潛蠅危害蔬菜，2006入侵到海南。近年來，該蟲已經(jīng)成為我國蔬菜特別是豇豆上的重要防治對象之一。當(dāng)前化學(xué)防治仍然是控制斑潛蠅的主要手段，而過度使用化學(xué)農(nóng)藥會導(dǎo)致斑潛蠅抗藥性問題，同時，也嚴(yán)重威脅到蔬菜的可持續(xù)生產(chǎn)和食品質(zhì)量。

擬除蟲菊酯類殺蟲劑是一種重要的農(nóng)藥，具有高效、低毒和易分解的特點(diǎn)，廣泛用于防治多種農(nóng)業(yè)害蟲，大量使用會導(dǎo)致許多昆蟲產(chǎn)生了高度的抗性。昆蟲神經(jīng)細(xì)胞膜電壓敏感鈉離子通道是擬除蟲菊酯類殺蟲劑的主要作用靶標(biāo)，由鈉離子通道靶標(biāo)部位敏感度降低而對DDT和擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生的抗性，叫擊倒抗性(Knowdown resisitance，kdr)，這是昆蟲對菊酯類農(nóng)藥產(chǎn)生抗性最重要的機(jī)制。分子遺傳學(xué)研究表明，擊倒抗性表型與鈉離子通道突變位點(diǎn)連鎖，檢測昆蟲突變基因的頻率可以監(jiān)測抗性水平。目前，國內(nèi)針對三葉斑潛蠅抗藥性研究還很少，關(guān)于三葉斑潛蠅擊倒性抗性研究也未見報道，利用現(xiàn)有研究還無法對三葉斑潛蠅抗藥性特別是擊倒性抗性突變位點(diǎn)進(jìn)行有效快速監(jiān)控；因此，有必要研制一種鑒定三葉斑潛蠅擊倒抗性相關(guān)突變位點(diǎn)的方法和專用引物，用于快速監(jiān)測三葉斑潛蠅對擬除蟲菊酯類藥劑的抗性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定三葉斑潛蠅鈉離子通道基因突變的方法及專用引物，且特別是提供一種鑒定三葉斑潛蠅鈉擊倒抗性相關(guān)突變位點(diǎn)L1014F和M918T的方法及其專用引物，用于監(jiān)測三葉斑潛蠅對擬除蟲菊酯類藥劑的抗性，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出如下技術(shù)方案：

一種鑒定三葉斑潛蠅鈉離子通道基因突變的方法及專用引物，包括鑒定三葉斑潛蠅擊倒抗性相關(guān)突變位點(diǎn)M918T和L1014F的方法和專用引物。

所述專用引物包含擴(kuò)增引物和測序引物；

所述擴(kuò)增引物包括正向引物和反向引物；

所述擴(kuò)增引物的正向引物L(fēng)T5F序列如SEQ ID NO.1所示；所擴(kuò)增引物的反向引物L(fēng)T5R 序列如SEQ ID NO.2所示；

所述測序引物的同擴(kuò)增引物的反向引物L(fēng)T5R。

所述鑒定三葉斑潛蠅擊倒抗性相關(guān)突變位點(diǎn)L1014F和M918T的方法：利用所述的擴(kuò)增引物L(fēng)T5F對三葉斑潛蠅DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物純化回收；通過二代測序技術(shù)，利用所述的測序引物對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，根據(jù)核苷酸序列，檢測出三葉斑潛蠅鈉離子通道擊倒抗性相關(guān)突變位點(diǎn)；儀器設(shè)備為常規(guī)分子生物學(xué)儀器，如PCR儀、移液槍等。