[發(fā)明專利]一種鑒定三葉斑潛蠅鈉離子通道基因突變的方法及專用引物

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011161459.1
• 申請(qǐng)日: 2020-10-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112342299A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳少英;吳建濤;李芬;王顥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 海南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種鑒定三葉斑潛蠅鈉離子通道基因突變方法及專用引物，包括鑒定三葉斑潛蠅擊倒抗性相關(guān)突變位點(diǎn)L1014F和M918T的方法和專用引物，其特征在于：所述專用引物包含擴(kuò)增引物和測(cè)序引物；所述擴(kuò)增引物包括正向引物和反向引物；

所述擴(kuò)增引物的正向引物L(fēng)T5F序列，如SEQ ID NO.1所示；所述所擴(kuò)增引物的反向引物L(fēng)T5R序列，如SEQ ID NO.2所示；

所述測(cè)序引物序列同擴(kuò)增引物的反向引物序列LT5R；

所述鑒定三葉斑潛蠅擊倒抗性相關(guān)突變位點(diǎn)L1014F和M918T的方法是：利用所述的擴(kuò)增引物L(fēng)T5F對(duì)三葉斑潛蠅DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物純化回收；通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)，利用所述的測(cè)序引物對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，根據(jù)核苷酸序列，檢測(cè)出三葉斑潛蠅鈉離子通道擊倒抗性L014F和M918T突變位點(diǎn)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定三葉斑潛蠅鈉離子通道基因突變方法及專用引物，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增體系為：Green Taq Mix(含Taq DNA Polymerase、dNTPs以及優(yōu)化緩沖體系的2×Master Mix)25μL，10M正向引物2μL，10M反向引物2μL，單頭DNA模板5μL，用雙蒸水補(bǔ)足至50μL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定三葉斑潛蠅鈉離子通道基因突變方法及專用引物，其特征在于：所述PCR擴(kuò)展程序?yàn)椋?5℃，3min；(95℃，15s；60℃，15s；72℃，30s)×30；72℃，5min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定三葉斑潛蠅鈉離子通道基因突變方法及專用引物，其特征在于：所述PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增量為5-10管200μL規(guī)格微量離心管。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定三葉斑潛蠅鈉離子通道基因突變方法及專用引物，其特征在于：所述PCR產(chǎn)物純化回收的程序?yàn)椋豪肞CR產(chǎn)物純化回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物純化回收，用移液槍確定PCR產(chǎn)物體積，加入5倍體積的CP Buffer；吸打混合均勻后，放入到離心柱里，13000rpm離心1min，倒掉廢液；加入700μL DNA wash Buffer，13000rpm離心1min，倒掉廢液，重復(fù)1次；13000rpm離心2min后，加入30-50μL Elution Buffer于離心柱中間的白色部分，下接1.5mL離心管，室溫靜置2min，13000rpm離心1min；取20-30μL送樣測(cè)序。