[發明專利]一種核酸適配體文庫的高通量測序文庫構建方法

在審

• 申請號: 202011157792.5
• 申請日: 2020-10-26
• 公開（公告）號: CN112226822A
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 鄭洪坤;駱晨;張雪川;許國路;李緒明;康靖民;畢經德
• 申請（專利權）人: 北京百邁客生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/10
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 商秀玲

本發明涉及核酸適配體篩選技術領域，具體涉及一種核酸適配體文庫的高通量測序文庫構建方法。本發明的測序文庫構建方法包括將靶向篩選得到的核酸適配體文庫去除引物殘留后再構建PCR?Free測序文庫。本發明的測序文庫構建方法中，利用硅膠柱膜純化技術降低了核酸適配體文庫本身存在的引物殘留，從而增加了后續有效數據的產出和分析，實現了核酸適配體文庫信息的完整、準確保留；利用PCR?Free建庫技術避免了PCR擴增過程中氣溶膠的污染以及PCR擴增偏好性和擴增酶性能差異導致的堿基偏好，保證了測序數據分析的有效性，同時保證了測序文庫的構建效率和質量。

技術領域

本發明涉及核酸適配體篩選技術領域，具體涉及一種核酸適配體文庫的高通量測序文庫構建方法。

背景技術

核酸適配體是能夠與目標物高親和特異性結合的單鏈短DNA/RNA，其不僅具有高度穩定的三維結構和低免疫原性，而且合成簡便、無批次之間差異，因此被廣泛應用于環境監察、食品安全檢查以及臨床診斷和治療。核酸適配體文庫可以根據不同類型指數富集配體系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponential Enrichment，SELEX)從10¹⁴～10¹⁶單鏈核酸組成的文庫中篩選獲得，這些單鏈核酸序列由中間隨機序列和兩端固定引物結合序列組成。

對于核酸適配體序列優化的方法主要有酶切保護實驗、生物信息預測、芯片分析法、二代測序法等，其中，二代測序技術是目前應用較廣的核酸適配體序列優化方法。核酸適配體文庫在二代測序的PCR過程中容易造成氣溶膠污染同時也易產生擴增偏好性和引物殘留問題，從而一定程度地影響適配體篩選的準確性。

發明內容

本發明的目的是提供一種核酸適配體文庫的高通量測序文庫構建方法，利用該方法構建得到的高通量測序文庫能夠準確、完整地保留核酸適配體文庫的真實信息，提高核酸適配體文庫篩選的準確性。

為實現上述目的，本發明通過在測序文庫構建前先去除核酸適配體文庫中因SELEX擴增等殘留的引物，再利用PCR-Free技術進行測序文庫構建，有效解決了PCR擴增偏好性和引物殘留問題，更準確保留了核酸適配體文庫的原始信息，提高了適配體文庫篩選的準確性。

具體地，本發明的技術方案如下：

本發明提供一種核酸適配體文庫的高通量測序文庫的構建方法，包括：將靶向篩選得到的核酸適配體文庫去除引物殘留后再構建PCR-Free測序文庫。

以上所述方法中，去除引物殘留采用能夠去除小片段核酸的膜純化方法。

優選地，采用能夠去除≤70bp核酸的硅膠柱膜純化方法去除引物殘留。

以上所述的膜純化去除引物殘留可采用常規的膜純化操作方法進行，例如：所述方法至少包括：將核酸適配體文庫與結合液混合后上柱、結合、漂洗、洗脫等步驟。

作為本發明的一種實施方式，采用QIAGEN MinElute PCR純化試劑盒去除核酸適配體文庫中的引物殘留。

利用膜純化方法雖然能夠有效去除核酸適配體文庫中的引物殘留，但同時會使得核酸適配體文庫的總量一定程度的降低，因此，本發明進一步通過優化PCR-Free測序文庫構建方法更好地保證了測序文庫的構建效率和質量。

本發明所述的PCR-Free測序文庫的構建包括如下步驟：

(1)末端修復和3’末端加A；

(2)接頭連接。

以上步驟(2)中，接頭連接的反應條件為：18℃～30℃反應30～50min。