[發明專利]一種核酸適配體文庫的高通量測序文庫構建方法

在審

• 申請號: 202011157792.5
• 申請日: 2020-10-26
• 公開（公告）號: CN112226822A
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 鄭洪坤;駱晨;張雪川;許國路;李緒明;康靖民;畢經德
• 申請（專利權）人: 北京百邁客生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/10
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 商秀玲

1.一種核酸適配體文庫的高通量測序文庫構建方法，其特征在于，包括：將靶向篩選得到的核酸適配體文庫去除引物殘留后再構建PCR-Free測序文庫。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述去除引物殘留采用能夠去除小片段核酸的膜純化方法；

優選地，采用能夠去除≤70bp核酸的硅膠柱膜純化方法去除引物殘留。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR-Free測序文庫的構建包括如下步驟：

(1)末端修復和3’末端加A；

(2)接頭連接；

所述接頭連接的反應條件為：18℃～30℃反應30～50min；

優選地，所述接頭連接的反應條件為：23～28℃反應5～15min，18～22℃反應20～40min。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述接頭連接的反應體系中，接頭與末端修復和3’末端加A產物的摩爾比為10：1～100：1；優選為20：1～30：1。

5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述接頭連接的65μL反應體系如下：T4DNA連接酶10～50U/μL，反應體系總體積的1/10的10×反應緩沖液，接頭10～60pmol，末端修復和3’末端加A產物0.5～2pmol，以水補足反應體系。

6.根據權利要求3～5任一項所述的方法，其特征在于，所述末端修復和3’末端加A的反應體系如下：dATP 0.6～0.7mM，dCTP 0.2～0.3mM，dTTP 0.2～0.3mM，dGTP 0.2～0.3mM，ATP 0.2～0.3mM，Tris-HCl 15～25mM，KCl 25～35mM，MgCl₂ 1～1.5mM，DTT 3.5～4.5mM，T4 DNA聚合酶0.01～0.03U/μL，T4多聚核苷酸激酶0.08～0.12U/μL，Taq DNA聚合酶0.01～0.02U/μL，純化后的核酸適配體文庫0.02～20ng/μL，以水補足反應體系。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述末端修復和3’末端加A的反應條件如下：20℃～30℃反應20～30min；72℃，反應10min～20min。

8.根據權利要求3～7任一項所述的方法，其特征在于，所述PCR-Free測序文庫的構建還包括采用磁珠純化接頭連接產物。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述磁珠的用量為與所述接頭連接產物的體積比為(0.8～2)：1。

10.權利要求1～9任一項所述的方法在核酸適配體篩選中的應用。