[發明專利]一種用于鑒定草魚出血熱病毒的引物及探針以及檢測方法

在審

• 申請號: 202011153888.4
• 申請日: 2020-10-26
• 公開（公告）號: CN112048575A
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 汪忠榮;畢峻龍;黎明
• 申請（專利權）人: 深圳市萊孚生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6806;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 深圳市中智立信知識產權代理有限公司 44427
• 代理人: 劉英玉

本發明提出了一種用于鑒定草魚出血熱病毒的引物及探針以及檢測方法，首先從草魚出血熱病毒基因序列中找到一段特征序列，然后針對該序列設計一組靈敏結合目的片段擴增的上下游引物，探針上標記有高熒光強度的Fam發光基團，以提高檢測時的靈敏度。

技術領域

本發明涉及病毒檢測領域，具體涉及一種用于鑒定草魚出血熱病毒的引物及探針以及檢測方法。

背景技術

草魚出血熱病毒屬于呼腸弧病毒科，感染病魚的各個器官組織呈現不同程度的充血式出血。目前這類病毒最有效可靠的檢測方法是熒光pcr，文獻沒有查閱到該病毒相關的檢測研究，市面上草魚出血熱病毒供應商有上海康朗生物科技有限公司、上海烜雅生物科技有限公司等。本發明旨在研發一種快速靈敏檢測草魚出血熱病毒的方法，幫助水產養殖早期發現病毒，及時處理減少損失。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提出一種能有效評估草魚出血熱病毒的檢測方法，從草魚出血熱病毒基因序列中找到一段特征序列，針對該序列設計一組靈敏結合目的片段擴增的上下游引物，探針上標記了高熒光強度的Fam發光基團，提高檢測靈敏度。

本發明的技術方案是這樣實現的：

一種用于鑒定草魚出血熱病毒的引物，其特征在于，包括有：

上游引物：5′-CTTCCGCTATTCCGTCTC-3′

下游引物：5′-CTCCATCATCGTGCTGTT-3′

進一步改進在于：所述引物對應的特征序列如SEQ ID NO.1。

進一步改進在于：所述引物對應的SEQ ID NO.1特征序列的探針的核苷酸序列為：

5′-Fam CTCTTTCCCCACGTCCACTTTTCC BHQ1-3′

進一步改進在于：所述述探針帶有標記物。

進一步改進在于：所述標記物為高熒光強度的Fam發光基團。

一種用于鑒定草魚出血熱病毒的檢測方法，其特征在于，包括以下檢測方法：

步驟一：用移液槍取200μl待測樣品，并加入到1.5ml離心管中；

步驟二：在離心管中加入500μl裂解液，震蕩混勻，室溫靜置；

步驟三：將離心管中的溶液全部轉移至吸附柱中并蓋上管蓋，然后摒棄廢液，將吸附柱放回收集管中；

步驟四：打開吸附柱蓋子，加入600μl洗滌液，并蓋上管蓋，保持12000轉離心30s,然后摒棄廢液，將吸附柱放回收集管；

步驟五：繼續重復步驟4，打開吸附柱蓋子，加入600μl洗滌液，并蓋上管蓋，保持12000轉離心30s,然后摒棄廢液，將吸附柱放回收集管；

步驟六：將吸附柱放回收集管中，并保持12000轉離心2min，以去除殘留液體；

步驟七：將吸附柱放入一個新的1.5ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50μL洗脫液，室溫靜置1min，并保持12000轉離心30s，最后得到RNA/DNA核酸模板；

步驟八：取四個PCR管，依次分別加入5μl酶液、18μl反應液、2μl陰性參照/陽性參照/提取樣本；

步驟九：加完樣后振蕩混勻，并在500g離心機中離心30s，并最后得出檢測結果。

進一步改進在于，步驟二中，在離心管中加入500μl裂解液，震蕩混勻后，用戶根據條件選擇室溫靜置5-10分鐘或者在60℃熱浴中靜置5-10分鐘。