[發明專利]一種用于鑒定草魚出血熱病毒的引物及探針以及檢測方法

在審

• 申請號: 202011153888.4
• 申請日: 2020-10-26
• 公開（公告）號: CN112048575A
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 汪忠榮;畢峻龍;黎明
• 申請（專利權）人: 深圳市萊孚生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6806;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 深圳市中智立信知識產權代理有限公司 44427
• 代理人: 劉英玉

1.一種用于鑒定草魚出血熱病毒的引物，其特征在于，包括有：

上游引物：5′-CTTCCGCTATTCCGTCTC-3′

下游引物：5′-CTCCATCATCGTGCTGTT-3′

2.根據權利要求1所述的一種用于鑒定草魚出血熱病毒的引物，其特征在于，所述引物對應的特征序列如SEQ ID NO.1。

3.根據權利要求2所述的一種用于鑒定草魚出血熱病毒的引物，其特征在于，所述引物對應的SEQ ID NO.1特征序列的探針的核苷酸序列為：

5′-Fam CTCTTTCCCCACGTCCACTTTTCC BHQ1-3′

4.根據權利要求3所述的一種用于鑒定草魚出血熱病毒的引物，其特征在于，所述述探針帶有標記物。

5.根據權利要求3所述的一種用于鑒定草魚出血熱病毒的引物，其特征在于，所述標記物為高熒光強度的Fam發光基團。

6.一種用于鑒定草魚出血熱病毒的檢測方法，其特征在于，包括以下檢測方法：

步驟一：用移液槍取200μl待測樣品，并加入到1.5ml離心管中；

步驟二：在離心管中加入500μl裂解液，震蕩混勻，室溫靜置；

步驟三：將離心管中的溶液全部轉移至吸附柱中并蓋上管蓋，然后摒棄廢液，將吸附柱放回收集管中；

步驟四：打開吸附柱蓋子，加入600μl洗滌液，并蓋上管蓋，保持12000轉離心30s,然后摒棄廢液，將吸附柱放回收集管；

步驟五：繼續重復步驟4，打開吸附柱蓋子，加入600μl洗滌液，并蓋上管蓋，保持12000轉離心30s,然后摒棄廢液，將吸附柱放回收集管；

步驟六：將吸附柱放回收集管中，并保持12000轉離心2min，以去除殘留液體；

步驟七：將吸附柱放入一個新的1.5ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50μL洗脫液，室溫靜置1min，并保持12000轉離心30s，最后得到RNA/DNA核酸模板；

步驟八：取四個PCR管，依次分別加入5μl酶液、18μl反應液、2μl陰性參照/陽性參照/提取樣本；

步驟九：加完樣后振蕩混勻，并在500g離心機中離心30s，并最后得出檢測結果。

7.根據權利要求1所述的一種能有效評估草魚出血熱病毒的檢測方法，其特征在于，步驟二中，在離心管中加入500μl裂解液，震蕩混勻后，用戶根據條件選擇室溫靜置5-10分鐘或者在60℃熱浴中靜置5-10分鐘。

8.根據權利要求1所述的一種能有效評估草魚出血熱病毒的檢測方法，其特征在于，在步驟三中，將離心管中的溶液全部轉移至吸附柱中并蓋上管蓋，保持12000轉離心30s；如果離心管中的溶液存在絮狀或顆粒狀沉淀則保持8000轉離心2min，然后取上清液轉移至吸附柱中，以防止堵塞濾膜。

9.根據權利要求1所述的一種能有效評估草魚出血熱病毒的檢測方法，其特征在于，在步驟七中，50μL洗脫液滴加在吸附柱的濾膜上。