[發明專利]葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202011152051.8
• 申請日: 2020-10-23
• 公開（公告）號: CN114480606A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 段志峰
• 申請（專利權）人: 廣州源古紀科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6837;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種葡萄糖?6?磷酸脫氫酶缺乏癥檢測試劑盒，引物組；所述引物組為利用生物信息學知識和相關生物信息學軟件，對公開數據庫中所能檢索到的葡萄糖?6?磷酸脫氫酶缺乏癥致病基因G6PD的c.1376，c.1388位點核酸序列信息，用PrimerExpressSoftware5.0軟件設計PCR引物；所述引物包括擴增引物G6PD?F、G6PD?R和測序引物M13F、M13R，其堿基序列為：G6PD?F：TGCCAAACGACGGTTAGTGCAGGGGTCGTCCTCTA；G6PD?R：AAGGTATGACCATGCACCTGCCATAAATATAGGGGAT；M13F：TGCCAAACGACGGCCAAAGTC；M13R：AGCTATGACCATGAAC；采用多重PCR的方法對待檢測樣本進行PCR擴增；將PCR擴增產物進行擴增子文庫的構建，ISP模板的制備，在IonTorrentPGM系統上進行測序，并用軟件對相關測序序列進行分析。本發明設計了擴增G6PD基因c.1376,c.1388位點的引物，采用PCR技術，構建了穩定的擴增體系。通過調整引物濃度、退火溫度等反應條件，可使擴增效率達到最佳。

技術領域

本發明涉及生物化學技術領域，具體涉及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

G6PD缺乏癥是最常見的一種遺傳性酶缺乏病,俗稱蠶豆病,全世界約4億人受累。我國是本病的高發區之一，約有1億G6PD缺乏癥患者，主要分布在長江以南各省，以海南、廣東、廣西、云南、貴州、四川等省為高。該病特征是平時無癥狀，但患者的紅細胞容易受到某些特定物質的破壞而發生溶血，導致溶血性貧血、藥物性溶血、感染性溶血、蠶豆病等，最嚴重的是新生兒溶血，導致核黃疸從而發展為兒童終身智力低下或死亡。

G6PD基因突變是引起G6PD缺乏癥的主要原因。G6PD基因定位于X染色體，男性只有一條X染色體，一旦有G6PD基因缺陷，則表現為G6PD嚴重缺乏。女性有兩條X染色體，若一條染色有G6PD基因缺陷，則為雜合子，其臨床表現變化很大，其酶活性可從正常至完全缺乏，給檢出造成困難。如果2條X染色體都有G6PD基因缺陷，則為純合子，表現為G6PD嚴重缺乏。在女性G6PD基因缺陷者中，多以致病基因攜帶者(雜合子)普遍存在人群中，且酶活性不定；但女性雜合子會將致病基因傳給下一代，如在她們妊娠、生產、哺乳期發生急性溶血，會導致新生兒溶血、新生兒核黃疸或發育生長遲緩等。

現有的基因診斷方法可較好的解決G6PD缺乏癥女性雜合子檢出的問題，但是當前常規的基因診斷方法也普遍存在操作繁瑣、通量低、易存在假陰性或假陽性現象而導致漏診、誤診等缺點，均無法成為臨床基因診斷的最佳選擇。例如，等位基因特異性寡核苷酸探針雜交法需要較為繁瑣的聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction,PCR)后雜交盒洗脫等步驟，雜交及洗脫條件的控制給該方法帶來眾多誤診及漏診的可能；多重等位基因特異性PCR法經濟、簡便，但該方法對引物設計要求較高，且在PCR反應體系中，多對引物可能存在相互干擾，會對結果產生影響；高分辨率熔解曲線法操作簡便，但對于不同突變位點的檢測，往往需要多管操作，通量較低，而單管多位點檢測結果較難判讀，臨床應用受限。CN103695554A等開發了針對G6PD缺乏癥診斷用基因檢測膜條及相關引物，針對G6PD缺乏癥已報道的十余個常見突變位點進行檢測，但位點覆蓋不夠全面，可能會造成漏診，不利于該疾病的遺傳篩查及提前干預等。CN104450925A等利用熒光定量PCR，設計覆蓋多數G6PD突變人群的常見位點引物及探針，以對其進行單獨分型，但仍存在缺乏標準化程序、儀器規格和試劑選擇等的多樣性使部分結果重復性差等不足，給其廣泛開展帶來阻礙。CN104450925A等則利用PCR結合一代測序的方法，擴增G6PD基因所有外顯子并進行直接測序，以提高患者及攜帶者的檢出率，但該方法操作復雜，許多外顯子擴增效果不佳、存在雜峰或峰圖不完整、質量差，較難適用于臨床的常規檢測。因此，本領域仍然需尋求一種新的G6PD缺乏癥疾病遺傳檢測技術。

發明內容

本發明旨在克服上述現有技術的至少一種缺陷，提供一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥檢測試劑盒及檢測方法，以達到準確率高，操作簡單的目的。