[發明專利]一種檢測三七葉片皂苷的HPLC方法

在審

• 申請號: 202011150157.4
• 申請日: 2020-10-24
• 公開（公告）號: CN112285239A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 張廣輝;賈兵;范偉;陳庚;李曉波;李瑩;宋婉玲;楊生超;盧迎春;劉冠澤;張雙艷;林源
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/34;G01N30/60
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 于洪;陳左

1.一種檢測三七葉片皂苷的HPLC方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟（1），供試樣品溶液的制備：將三七葉在采收后及時烘干，溫度為55℃-60℃，研磨成粉末狀，過45目篩，過篩后的篩下三七葉粉加入氯仿，靜置過夜10-12h，過濾，棄除上清液，取沉淀，待沉淀自然風干后再加入氯仿，靜置2-3h后，再次過濾，取沉淀，待沉淀自然風干后，取風干后粉末加入甲醇，靜止30-40min后超聲提取20-30min，靜置1-2h，使之冷卻至室溫，最后用甲醇精密定量，緩慢搖勻，靜置30-40min后，取液體，使用0.45微米濾膜過濾，獲得供試液；

其中，三七葉粉、第一次氯仿用量、第二次氯仿用量的比例為1g：50mL：30mL；風干后粉末與甲醇用量的比例為0.6g：50mL；最后用甲醇精密定量至風干后粉末與最終精密定量體積的比例為0.6g：50mL；

步驟（2），對照品溶液的制備：取人參皂苷Rb₁、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb₂、人參皂苷Rb₃、三七皂苷Fa、三七皂苷Fe及七葉膽苷XⅦ對照品，加入到甲醇中，制得混合對照品溶液；混合對照品溶液中人參皂苷Rb₁、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb₂、人參皂苷Rb₃、三七皂苷Fa、三七皂苷Fe及七葉膽苷XⅦ對照品的濃度分別為330 μg/ml、222 μg/ml、230 μg/ml、310 μg/ml、231μg/ml、204 μg/ml、248 μg/ml的混合對照品溶液；

步驟（3），色譜條件：色譜柱以SB-C18為填充劑，以質量濃度為0.2%的磷酸水溶液為A流動相，以乙腈為B流動相進行線性梯度洗脫；進樣體積10μL，流速1.0mL/min，柱溫25℃，檢測波長為203nm，理論板數不低于5000；

步驟（4），色譜峰測定：分別取對照品溶液、供試品溶液注入高效液相色譜儀，計算同一保留時間下的峰面積，代入標準曲線方程，即計算出人參皂苷Rb₁、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb₂、人參皂苷Rb₃、三七皂苷Fa、三七皂苷Fe及七葉膽苷XⅦ的含量。

2.根據權利要求1所述的檢測三七葉片皂苷的HPLC方法，其特征在于，所述的色譜柱為安捷倫ZORBAX SB-C18，250 mm × 4.6 mm，5 μm。

3.根據權利要求1所述的檢測三七葉片皂苷的HPLC方法，其特征在于，高效液相色譜儀Agilent 1260型高效液相色譜儀，儀器組成包括G1311C四元泵、G1329B自動進樣儀和G1315D光電二極管陣列檢測器。

4.根據權利要求1所述的檢測三七葉片皂苷的HPLC方法，其特征在于，線性梯度洗脫程序如下：

0-28min，流動相B相所占的體積比為27%；

28-44min，流動相B相所占的體積比為34%；

44-47min，流動相B相所占的體積比為39%；

47-50min，流動相B相所占的體積比為60%；

50-52min，流動相B相所占的體積比為80%；

52min之后，流動相B相所占的體積比為85%。

5.根據權利要求1所述的檢測三七葉片皂苷的HPLC方法，其特征在于，所述的標準曲線方程的繪制：將制備的人參皂苷Rb₁、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb₂、人參皂苷Rb₃、三七皂苷Fa、三七皂苷Fe及七葉膽苷XⅦ對照品溶液分別稀釋3.30、2.22、2.30、3.10、2.31、2.04、2.48倍，之后在步驟（3）的色譜條件下，注入高效液相色譜儀，分別計算同一保留時間下的峰面積，以濃度x為橫坐標，以峰面積y為縱坐標繪制標準曲線，做出標準曲線方程：y＝f(x)。