[發明專利]一種高靈敏度的單組分TMB顯色液及其制備方法

在審

• 申請號: 202011149776.1
• 申請日: 2020-10-23
• 公開（公告）號: CN112410399A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 周志鵬
• 申請（專利權）人: 杭州聯科生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/28
• 分類號: C12Q1/28
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 周瓊

本發明公開了一種高靈敏度的單組分TMB顯色液，包括以下組分：聚乙烯醇0.001g/L?20g/L，木糖0.16g/L?30g/L，檸檬酸1mM?100mM，乙二胺四乙酸二鈉1mM?20mM，30％過氧化氫水溶液1mM?10mM，TMB 1mM?3mM，DMSO 20ml/L?30ml/L，Proclin300 0.04％，磷酸氫二鈉1mM?25mM，超純水定容至1L。一種高靈敏度的單組分TMB顯色液的制備方法，包括以下步驟：步驟一：試劑母液配制：1.1：50g/L低粘度聚乙烯醇1788配制：準確稱取5g 1788低粘度型聚乙烯醇于燒杯中，加入適量超純水，置于65℃恒溫水浴鍋中，通過玻璃棒持續攪拌使顆粒分散均勻，溶解后繼續保溫2小時，超純水定容至100ml，使用0.45μm濾膜過濾。本發明具有檢測本底低的特點，有效提高了低濃度樣本的檢出率，不需要進行傳統A液、B液的混合，為用戶的操作提供了便利，使得本發明整體上具有突出性的進步。

技術領域

本發明涉及TMB顯色液技術領域，尤其涉及一種高靈敏度的單組分TMB顯色液及其制備方法。

背景技術

在酶聯免疫吸附測定試驗(ELISA)中，辣根過氧化物酶(HRP)催化過氧化物分解，釋放出氧氣，將顯色液底物氧化，溶液變藍。加入強酸后終止反應，藍色溶液變黃，在450nm處有最大吸收峰，通過測量該吸光度值，結合標準曲線顯色情況，便可定量計算出被檢測物的含量。

常用的顯色液底物有鄰苯二胺(OPD)，2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)及3,3',5,5'-四甲基聯苯二胺(TMB)，研究表明，OPD有潛在的致癌性，而ABTS在顯色靈敏度上表現不佳，而TMB作為一種新型安全的色原試劑，以顯色高效、無毒、不致癌及穩定性好等特點，成為ELISA檢測的主流顯色劑。

由于TMB易被空氣環境中氧氣及溶液中過氧化物氧化，所以TMB顯色液的生產受到一定限制；當前市售的EILSA試劑盒所采用的TMB顯色液大多數為雙組分，分為A液和B液，這最大限度的減少了TMB與過氧化物的接觸，保證了顯色液的穩定性，但該顯色液使用時需先預混合，給操作造成不便，同時混合液使用后丟棄，造成一定程度的浪費。市售的ELISA試劑盒也有采用單組分TMB顯色液的，但現有單組分TMB顯色液存在存儲時間短、顯色背景高等問題；在檢測低目的蛋白表達豐度的樣本時，顯色背景高將直接導致樣本難以被檢測，造成部分漏檢情況。

綜上所述，需要一種高靈敏度的單組分TMB顯色液及其制備方法來解決現有技術中所存在的不足之處。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種高靈敏度的單組分TMB顯色液及其制備方法，旨在解決上述TMB顯色液存在存儲時間短、顯色背景高以及樣本難以被檢測，造成部分漏檢等問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種高靈敏度的單組分TMB顯色液，包括以下組分：聚乙烯醇0.001g/L-20g/L，木糖0.16g/L-30g/L，檸檬酸1mM-100mM，乙二胺四乙酸二鈉1mM-20mM，30％過氧化氫水溶液1mM-10mM，TMB 1mM-3mM，DMSO 20ml/L-30ml/L，Proclin3000.04％，磷酸氫二鈉1mM-25mM，超純水定容至1L。

進一步的，所述單組分TMB顯色液采用檸檬酸和磷酸氫二鈉緩沖液，且緩沖液的pH值為3.1-3.6。

進一步的，所述聚乙烯醇為1788低粘度型聚乙烯醇，且聚乙烯醇的聚合度為1700，醇解度為88％。

一種高靈敏度的單組分TMB顯色液的制備方法，包括以下步驟：

步驟一：試劑母液配制：

1.1：50g/L聚乙烯醇配制：準確稱取5g 1788低粘度型聚乙烯醇于燒杯中，加入適量超純水，置于65℃恒溫水浴鍋中，通過玻璃棒持續攪拌使顆粒分散均勻，溶解后繼續保溫2小時，超純水定容至100ml，使用0.45μm濾膜過濾；