[發(fā)明專利]一種桑樹線蟲傳多面體病毒的定量檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011147923.1
• 申請(qǐng)日: 2020-10-23
• 公開（公告）號(hào): CN112094951B
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孔衛(wèi)青;楊金宏;江微;黎歡吉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安康學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851
• 代理公司: 西安銘澤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種桑樹線蟲傳多面體病毒不同RNA鏈(poly1和poly2)的絕對(duì)定量檢測(cè)方法。本發(fā)明通過合成多種聚合的體外轉(zhuǎn)錄載體，制備RNA標(biāo)準(zhǔn)品，避免了因?yàn)閜oly1和poly2不同基因反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增效率差異，可以分別定量多面體病毒poly1和poly2兩條RNA，并進(jìn)行不同poly的拷貝數(shù)比較。同時(shí)本發(fā)明對(duì)提出的感染桑樹葉片樣本總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄→PCR→體外轉(zhuǎn)錄→核酶切割→電泳檢測(cè)排除假陽(yáng)性。既能夠?qū)?xì)胞內(nèi)病毒poly1和poly2分別進(jìn)行精準(zhǔn)定量，又可有效降低單基因檢測(cè)的假陽(yáng)性，解決了單純定量PCR檢測(cè)方法容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的弊端。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種桑樹線蟲傳多面體病毒不同RNA鏈(poly1和poly2)的定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

病毒往往給人類帶來災(zāi)難性、可怕的后果。其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，基因組僅僅包含DNA或者RNA，也有僅僅包含蛋白質(zhì)的朊病毒。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的病毒中，其中大部分為RNA病毒，但是不同RNA病毒含有的RNA基因組片段卻不一樣，例如甲型流感病毒基因組由8個(gè)線性的RNA基因組片段組成，編碼11個(gè)已知的病毒蛋白質(zhì)(一個(gè)基因組片段可以編碼1-2個(gè)蛋白質(zhì))。冠狀病毒只有1條基因片段，編碼多個(gè)蛋白質(zhì)。具有多個(gè)片段的病毒被稱為多分體病毒。

桑樹線蟲傳多面體病毒屬于小RNA病毒目(Picornavirales)，該目含有4個(gè)科，海洋RNA病毒科(Marnaviridae)，小RNA病毒科(Picornaviridae)，雙順反子病毒科(Dicistroviridae)，植物小RNA病毒科(Secoviridae)。

線蟲傳多面體病毒屬Nepovirus病毒基因組為雙分體基因，病毒粒子為等軸對(duì)稱的20面體(多面體)，直徑28nm，無(wú)包膜，外形常為六邊形，由60個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)亞基。病毒純化時(shí)分為頂部(T)、中部(M)和底部(B)三組分。兩條核酸為線形單股正鏈RNA，poly1長(zhǎng)6-9kb，poly2長(zhǎng)3-7kb。

由于PCR的非特異擴(kuò)增，目前對(duì)病毒的核酸檢測(cè)多是采用雙基因進(jìn)行檢測(cè)，大多不采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，該方法無(wú)法準(zhǔn)確定量。采用DNA質(zhì)粒進(jìn)行定量的方法容易檢測(cè)不到逆轉(zhuǎn)錄過程的影響，仍然沒有辦法進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。現(xiàn)有技術(shù)也有對(duì)HIV病毒檢測(cè)中采用體外轉(zhuǎn)錄RNA定量的報(bào)道，但是對(duì)于多分體基因病毒，則未見綜合考量正負(fù)鏈，不同鏈之間差異的定量(尤其是宿主中拷貝數(shù)的確定)的檢測(cè)方法。

對(duì)于桑樹線蟲多面體病毒，其線蟲傳多面體病毒屬病毒的2條RNA鏈在植物體內(nèi)并不是均勻存在，其2條RNA鏈的比例對(duì)于確定侵染時(shí)期和危害程度預(yù)測(cè)具有重要意義，甚至有報(bào)道僅有poly1的低水平感染情況，而植物中也存在只有一條poly2鏈的死病毒顆粒的情況。而且2條鏈基因不同，對(duì)于反轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄效率也不一樣，這都增加了準(zhǔn)確定量的難度。同時(shí)由于PCR的非特異擴(kuò)增，假陽(yáng)性和假陰性現(xiàn)象的存在，造成了核酸檢測(cè)的疑似情況屢見不鮮。如何在PCR的基礎(chǔ)上進(jìn)一步確定序列，并實(shí)現(xiàn)桑樹線蟲傳多面體病毒的精準(zhǔn)定量，已經(jīng)是一個(gè)亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種桑樹線蟲傳多面體病毒的定量檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的是提供一種桑樹線蟲傳多面體病毒的定量檢測(cè)方法，包括：

步驟一、RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備

體外合成具有間隔的體外轉(zhuǎn)錄載體，核苷酸序列參見SEQ?ID?NO.1；

利用T7體外轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄SEQ?ID?NO.1的序列，測(cè)定其濃度，得RNA預(yù)標(biāo)準(zhǔn)品一；

利用SP6體外轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄SEQ?ID?NO.1的序列，測(cè)定其濃度，得RNA預(yù)標(biāo)準(zhǔn)品二；

將RNA預(yù)標(biāo)準(zhǔn)品一和RNA預(yù)標(biāo)準(zhǔn)品二混合，最終得到RNA標(biāo)準(zhǔn)品；

步驟二、提取健康和感染線蟲傳多面體病毒桑樹葉片的總RNA；

步驟三、反轉(zhuǎn)錄