[發明專利]一種桑樹線蟲傳多面體病毒的定量檢測方法

有效

• 申請號: 202011147923.1
• 申請日: 2020-10-23
• 公開（公告）號: CN112094951B
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 孔衛青;楊金宏;江微;黎歡吉
• 申請（專利權）人: 安康學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

1.一種桑樹線蟲傳多面體病毒的定量檢測方法，其特征在于，包括：

步驟一、RNA標準品的制備

體外合成具有間隔的體外轉錄載體，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.?1所示；

利用T7體外轉錄酶轉錄SEQ?ID?NO.?1的序列，測定其濃度，得RNA預標準品一；

利用SP6體外轉錄酶轉錄SEQ?ID?NO.?1的序列，測定其濃度，得RNA預標準品二；

將RNA預標準品一和RNA預標準品二混合，最終得到RNA標準品；

步驟二、提取健康和感染線蟲傳多面體病毒桑樹葉片的總RNA；

步驟三、反轉錄

將步驟一的RNA標準品與步驟二的健康桑樹總RNA按照1?:?10¹?~?10⁶體積比例混合后作為模板，反轉錄，得到標準品反轉錄樣品；

將感染線蟲傳多面體病毒桑樹葉片的總RNA為模板進行反轉錄，得到檢測樣反轉錄樣品；

步驟四、定量檢測

分別對步驟三所得標準品反轉錄樣品進行熒光定量PCR分析，制作濃度-Ct標準曲線；

利用熒光定量PCR對步驟三所得檢測樣反轉錄樣品中的poly1和poly2保守區域和桑樹內參基因組分別進行定量PCR分析，獲得的Ct值對應到濃度-Ct標準曲線上，獲得poly1和poly2濃度含量；

poly1的定量引物為：

RT-6309P1F：5’-CTTGCTGGTGCCTGGAT-3’

RT-6309P1R：5’-CCAACCAAGTTGCATCATGCG-3’

或者RT-6309P2F：5’-CTGGCACGCAAGTGGTA-3’

RT-6309P2R：5’-GTACACTATGGACCCTGGCAC-3’

Poly2的定量引物為：

RT-3279P1F：5’-GTTTTGGAGCCCACTTGTTCCCT-3’

RT-3279P1R：5’-ACTTCCCCTCCAGTCACAAC-3’

或者

RT-3279P2F：5’-CTCTTCCCTTTGATGTTCCCTT-3’

RT-3279?P2R：5’-AAACTCTCACCCTCAATACC-3’

內參引物為：

actin?F：5’-AGCAACTGGGATGACATGGA-3’

actin?R：5’?-CCAACACAATACCAGTTGTAC-3’；

步驟五、假陽性排除

利用帶有啟動子的引物對步驟三所得檢測樣反轉錄樣品進行PCR；電泳回收PCR產物，體外轉錄，核酶體外切割并電泳檢測；當步驟四和步驟五的檢測結果吻合，則證明步驟四的poly1和poly2含量計算結果為精準定量；

假陽性排除所用PCR引物為

6309P1F：

5’-agTAATACGACTCACTATAGGGCTTGCTGGTGCCTGGAT-3’

6309P1R：

5’-agATTTAGGTGACACTATAGCCAACCAAGTTGCATCATGCG-3’

和3279P1F：

5’-agTAATACGACTCACTATAGGGGTTTTGGAGCCCACTTGTTCCCT-3’

3279P1R：

5’-agATTTAGGTGACACTATAGAAACTCTCACCCTCAATACC-3’；

核酶的DNA序列如SEQ?ID?NO.?16、SEQ?ID?NO.?17或SEQ?ID?NO.?18所示。

2.根據權利要求1所述的桑樹線蟲傳多面體病毒的定量檢測方法，其特征在于，步驟一中T7或SP6體外轉錄酶轉錄產物分別保存在RNA保存液中，使用時，通過乙醇溶液沉淀、洗滌其中的RNA，ddH₂O重懸，得到相應的RNA預標準品；

RNA保存液配方2×：100mM?TCEP-HCl，甘油10mL/100mL，1-巰基甘油0.2?mL/100mL，Tris-HCl?30mM，EDTA?20mM，溶劑為ddH₂O，pH?5.0。