[發明專利]一種利用含雙特異性抗體的膠體金試紙條檢測細菌的方法

有效

• 申請號: 202011146123.8
• 申請日: 2020-10-23
• 公開（公告）號: CN112415204B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 王權;蔣蔚;辛思培;李思;顧惠明;耿小玲;劉琪
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心上海分中心）
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558;C07K16/46;C12N15/13
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;呂學辰

本發明公開了一種利用含雙特異性抗體的膠體金試紙條檢測細菌的方法。所述方法包括以下步驟：(1)將待測細菌和雙特異性抗體標記的膠體金反應得到細菌?雙特異性抗體膠體金復合物；(2)純化所述細菌?雙特異性抗體膠體金復合物并溶解于小分子半抗原?載體偶聯物標記的膠體金溶液，得到上樣液；(3)將所述上樣液滴加至所述膠體金試紙條上進行反應。本發明檢測細菌的方法可以在避免細菌聚集的同時提高檢測靈敏度，最佳可達2.5×10⁴CFU/mL，且所述雙特異性抗體的穩定性高。

技術領域

本發明屬于微生物檢測領域，具體涉及一種利用含雙特異性抗體的膠體金試紙條檢測細菌的方法。

背景技術

近年來，由食源性致病菌引發的食物中毒事件已廣為關注，引起這些中毒的細菌主要有：大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌以及單增李斯特菌等。這些菌會引起疾病的爆發和流行，給社會帶來巨大損失，如腸出血性大腸桿菌O157：H7可產生志賀毒素，能引起出血性腸炎、血小板減少性紫癜、溶血性尿毒癥等疾病。該菌主要通過污染食品、水源進行糞口傳播，而且其具有耐胃酸能力強、感染劑量低的特點，有報道稱數十個活菌即可造成人畜感染發病。檢測細菌的“金標準”需要通過平板計數分離和生理生化鑒定，操作復雜、耗時長。而膠體金免疫層析試紙條方法利用抗原抗體特異性結合反應，具有操作簡便、耗時短等特點，因而在微生物、藥物殘留等多個檢測領域被廣泛運用。

現有的關于膠體金試紙條檢測細菌的方法中，存在如下問題：

1、傳統的檢測細菌的免疫層析試紙條一般為利用雙抗夾心原理的膠體金試紙條方法，由于兩個抗體針對細菌的結合位點存在競爭；

2、作為檢測探針膠體金標記抗體的Fab存在兩個抗原結合片段，發生一個抗體可結合兩個細菌從而導致膠體金標記抗體與細菌在金標墊結合反應過程中造成細菌凝聚(這一點已在普通顯微鏡及掃描電鏡下得到驗證)，細菌凝聚成較大的顆粒后會導致在試紙條上進行層析時發生堵塞，形成不規則條帶，使遷移達到T線的膠體金標記抗體-細菌免疫復合物較少。

由于上述原因靈敏度僅能達到10⁶CFU/mL，但有些細菌如大腸桿菌O157:H7感染致病劑量低，因此傳統的檢測細菌的免疫層析試紙條的靈敏度亟需改進和提高。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是為解決現有膠體金試紙條檢測方法中細菌聚集從而導致試紙層析時發生堵塞、靈敏度不夠高、檢測所需時間較長等缺陷，提供了一種利用含雙特異性抗體的膠體金試紙條檢測細菌的方法。

本發明的發明人通過構思和驗證，發現了在膠體金試紙條檢測中利用雙特異性抗體可以避免細菌聚集并提高檢測的靈敏度。其中，所述雙特異性抗體的一個抗原結合位點結合所述待測細菌，另一個抗原結合位點結合所述小分子半抗原-載體偶聯物。在測試中完全避免細菌聚集，同時檢測靈敏度可達2.5×10⁴CFU/mL。另外，本發明所用雙特異性抗體的穩定性高，檢測結果穩定可靠；靈敏度的提高也帶來了檢測效率的提升。

為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案之一為：一種利用含雙特異性抗體的膠體金試紙條檢測細菌的方法，其包括以下步驟：

(1)將待測細菌和所述雙特異性抗體標記的膠體金反應得到細菌-雙特異性抗體膠體金復合物；

(2)純化所述細菌-雙特異性抗體膠體金復合物并溶解于小分子半抗原-載體偶聯物標記的膠體金溶液，得到上樣液；

(3)將所述上樣液滴加至所述膠體金試紙條上進行反應；

其中，所述雙特異性抗體的一個抗原結合位點結合所述待測細菌，另一個抗原結合位點結合所述小分子半抗原-載體偶聯物。

所述待測樣品、所述雙特異性抗體標記的膠體金和小分子半抗原-載體偶聯物標記的膠體金溶液的用量本領域人員可以常規確定，例如可參照本領域中含有單克隆抗體的膠體金試紙條檢測。