[發明專利]一種利用含雙特異性抗體的膠體金試紙條檢測細菌的方法

有效

• 申請號: 202011146123.8
• 申請日: 2020-10-23
• 公開（公告）號: CN112415204B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 王權;蔣蔚;辛思培;李思;顧惠明;耿小玲;劉琪
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心上海分中心）
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558;C07K16/46;C12N15/13
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;呂學辰

1.一種利用含雙特異性抗體的膠體金試紙條檢測細菌的方法，其包括以下步驟：

(1)將待測細菌和所述雙特異性抗體標記的膠體金反應得到細菌-雙特異性抗體膠體金復合物；

(2)純化所述細菌-雙特異性抗體膠體金復合物并溶解于含有小分子半抗原-載體偶聯物標記的膠體金和載體的溶液，得到上樣液；

(3)將所述上樣液滴加至所述膠體金試紙條上進行反應；

其中，所述雙特異性抗體的一個抗原結合位點結合所述待測細菌，另一個抗原結合位點結合所述小分子半抗原-載體偶聯物。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述雙特異性抗體包括Fab¹-Fc-Fab²結構。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測細菌為革蘭氏陰性菌和/或所述小分子半抗原-載體偶聯物中小分子半抗原為4-CPAOZ。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌(Escherichiacoli)；優選地，所述大腸桿菌為大腸桿菌O157；更優選地，所述大腸桿菌O157為大腸桿菌O157：H7。

5.如權利要求3或4任一項所述的方法，其特征在于，所述小分子半抗原-載體偶聯物中載體為BSA或OVA。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述小分子半抗原-載體復合物為4-CPAOZ-BSA，所述待測細菌為大腸桿菌O157：H7。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述雙特異性抗體按下述方法制備：

以AOZ為原料，制備4-CPAOZ-BSA作為完全抗原，利用所述完全抗原制備分泌抗4-CPAOZ-BSA抗體的免疫脾細胞；

制備滅活大腸桿菌O157:H7菌體抗原，利用滅活大腸桿菌O157:H7菌體抗原制備抗所述大腸桿菌O157:H7菌體抗原的免疫脾細胞，并利用所述免疫脾細胞制備抗大腸桿菌O157:H7菌體抗原的雜交瘤細胞；

融合所述分泌抗4-CPAOZ-BSA抗體的免疫脾細胞和所述抗大腸桿菌O157:H7菌體抗原的雜交瘤細胞，得到分泌所述雙特異性抗體的雜交瘤細胞，從所述分泌雙特異性抗體的雜交瘤細胞注射的小鼠腹腔液中提取所述雙特異性抗體；

優選地，所述雙特異性抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，編碼所述重鏈可變區的核酸序列分別如SEQ ID NO:1和3所示，編碼所述輕鏈可變區的核酸序列分別如SEQ ID NO:2和4所示。

8.如權利要求1-7任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟具體為：

從待測樣品中分離出細菌，向分離出的細菌加入所述雙特異性抗體標記的膠體金，反應后分離并純化所得細菌-雙特異性抗體膠體金復合物；

將所述細菌-雙特異性抗體膠體金復合物溶解于含所述小分子半抗原-載體偶聯物的PBST緩沖液中，得到所述膠體金試紙條的上樣液；

將所述上樣液滴加至所述膠體金試紙條上進行反應；

優選地，所述分離的方法為離心；更優選地，重復所述純化的步驟；

和/或，所述試紙條包括檢測線及質控線，所述檢測線包被抗所述雙特異性抗體的抗體，所述質控線包被抗所述小分子半抗原的抗體。

9.一種雙特異性抗體，其特征在于，所述雙特異性抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，編碼所述重鏈可變區的核酸序列分別如SEQ ID NO:1和3所示，編碼所述輕鏈可變區的核酸序列分別如SEQ ID NO:2和4所示；優選地，所述雙特異性抗體包括Fab¹-Fc-Fab²結構。

10.如權利要求9所述的雙特異性抗體在制備用于檢測細菌的膠體金試紙條中的應用。