[發明專利]利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質粒系統在真核細胞表達病毒蛋白的方法

在審

• 申請號: 202011145191.2
• 申請日: 2020-10-23
• 公開（公告）號: CN112301054A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 馮濤聲;劉定祥;李淑敏;丘祖純
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C07K14/165;C07K14/435
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

本發明公開了一種利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質粒系統在真核細胞質表達蛋白的方法。本發明通過將NP868R帽狀酶片段構建至含有K1E RNA聚合酶表達序列的載體，得到重組載體A；將目的蛋白的cDNA序列構建至含有K1E啟動子的載體，得到重組載體B；將重組載體A和重組載體B轉染至宿主真核細胞中進行表達，得到目的蛋白。本發明提供的方法能將難以通過傳統蛋白外源表達方法表達的蛋白進行表達，有助于開發特異性的抗病毒藥物和預防病毒感染的有效疫苗。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別涉及一種利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質粒系統在真核細胞質表達蛋白的方法。

背景技術

大部分的真核表達系統是利用宿主細胞的核轉錄和轉錄后機制，它們在生命科學領域中有著廣泛的應用，而基于質粒的表達系統卻仍然有很大的缺陷。首先，質粒DNA從細胞質轉移到細胞核在不分裂細胞中是一個限速的過程，在分裂細胞中這種限制基于質粒的真核表達系統效率的障礙因為在有絲分裂的過程中由于核膜的暫時性解體而被克服，因而這種在靜止細胞限制外源DNA轉移到細胞核的因素對于非病毒基因治療和DNA疫苗的接種療效是一個很大的缺陷；第二，基于質粒表達系統依賴于宿主細胞核RNA聚合酶II，這是一種中度的過程性酶，在體外和細胞中其延伸率分別是25和6個核苷酸/秒；第三，標準的基于質粒的真核表達系統利用宿主細胞的轉錄機制，進而與宿主細胞基因組競爭轉基因表達；第四，有些基因有潛在的內含子序列，進核的話會被剪接導致基因表達不出來。以上的這些挑戰都會限制真核表達系統的效率。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質粒系統在真核細胞質表達蛋白的方法。

本發明的另一目的在于提供上述方法的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質粒系統在真核細胞質表達蛋白的方法，包括如下步驟：

(1)將NP868R帽狀酶片段構建至含有K1E RNA聚合酶表達序列的載體，得到重組載體A；

(2)將目的蛋白的cDNA序列構建至含有K1E啟動子的載體，得到重組載體B；

(3)將步驟(1)得到的重組載體A和步驟(2)得到的重組載體B轉染至宿主真核細胞中進行表達，得到目的蛋白。

所述利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質粒系統在真核細胞質表達蛋白的方法，還包括如下步驟：

(4)檢測：

A)收集轉染后的細胞，凍融，得到檢測樣品；通過對目的蛋白的檢測，評估利用K1E噬菌體RNA 聚合酶和啟動子的雙質粒系統的表達效率；

B)當目的蛋白為熒光蛋白時，可選擇通過熒光強度的觀察初步評估利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質粒系統的表達效率。

步驟(1)中所述的NP868R帽狀酶片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

步驟(1)中所述的構建的方式優選為通過同源重組將NP868R帽狀酶片段構建至含有K1E RNA聚合酶表達序列的載體。

所述的同源重組的步驟優選具體如下：通過引物NP868R-F和NP868R-R擴增序列如SEQ ID NO.1所示的NP868R帽狀酶片段，得到片段A；通過EcoRI和BamHI雙酶切，將載體切成線性片段，得到片段B；通過同源重組酶將片段A和片段B進行同源重組連接，得到重組載體A；

NP868R-F：5’-GACTCACTATAGGGCGAATTGCCACCATGGCTTCTTTAG-3’；