[發(fā)明專利]利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質(zhì)粒系統(tǒng)在真核細胞表達病毒蛋白的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011145191.2
• 申請日: 2020-10-23
• 公開（公告）號: CN112301054A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馮濤聲;劉定祥;李淑敏;丘祖純
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C07K14/165;C07K14/435
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

1.一種利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質(zhì)粒系統(tǒng)在真核細胞質(zhì)表達蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)將NP868R帽狀酶片段構(gòu)建至含有K1E RNA聚合酶表達序列的載體，得到重組載體A；

(2)將目的蛋白的cDNA序列構(gòu)建至含有K1E啟動子的載體，得到重組載體B；

(3)將步驟(1)得到的重組載體A和步驟(2)得到的重組載體B轉(zhuǎn)染至宿主真核細胞中進行表達，得到目的蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質(zhì)粒系統(tǒng)在真核細胞質(zhì)表達蛋白的方法，其特征在于還包括如下步驟：

(4)檢測：

A)收集轉(zhuǎn)染后的細胞，凍融，得到檢測樣品；通過對目的蛋白的檢測，評估利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質(zhì)粒系統(tǒng)的表達效率；

B)當目的蛋白為熒光蛋白時，可選擇通過熒光強度的觀察初步評估利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質(zhì)粒系統(tǒng)的表達效率。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質(zhì)粒系統(tǒng)在真核細胞質(zhì)表達蛋白的方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的NP868R帽狀酶片段的序列如SEQ ID NO.1所示；

步驟(1)中所述的構(gòu)建的方式通過同源重組將NP868R帽狀酶片段構(gòu)建至含有K1E RNA聚合酶表達序列的載體；

步驟(1)中所述的含有K1E RNA聚合酶表達序列的載體為pXIP-myc-K1ERNAP；

所述的載體pXIP-myc-K1ERNAP通過如下步驟制備得到：將序列如SEQ ID NO.2所示的myc-K1ERNAP-IRES-puroR通過EcoRI和NotI酶切位點克隆至載體pXJ40中，得到載體pXIP-myc-K1ERNAP。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質(zhì)粒系統(tǒng)在真核細胞質(zhì)表達蛋白的方法，其特征在于：

所述的同源重組的步驟具體如下：通過引物NP868R-F和NP868R-R擴增序列如SEQ IDNO.1所示的NP868R帽狀酶片段，得到片段A；通過EcoRI和BamHI雙酶切，將載體切成線性片段，得到片段B；通過同源重組酶將片段A和片段B進行同源重組連接，得到重組載體A；

NP868R-F：5’-GACTCACTATAGGGCGAATTGCCACCATGGCTTCTTTAG-3’；

NP868R-R：5’-AGAACCTCCACCTCCGGATCCATTTTTGCGCAGACAAATAAACCC-3’。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質(zhì)粒系統(tǒng)在真核細胞質(zhì)表達蛋白的方法，其特征在于：

步驟(2)中所述的目的蛋白為病毒蛋白，或病毒蛋白和熒光蛋白；

步驟(2)中所述的構(gòu)建的方式為通過同源重組將目的蛋白的cDNA序列構(gòu)建至含有K1E啟動子的載體；

步驟(2)中所述的K1E啟動子的序列如下所示：TTACTGGACACTATAGAAG。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述利用K1E噬菌體RNA聚合酶和啟動子的雙質(zhì)粒系統(tǒng)在真核細胞質(zhì)表達蛋白的方法，其特征在于：

所述的病毒為雞傳染性支氣管炎病毒和冠狀病毒；

所述的病毒蛋白為病毒結(jié)構(gòu)蛋白和病毒非結(jié)構(gòu)蛋白中的至少一種；

所述的熒光蛋白為綠色熒光蛋白；

步驟(2)中所述的含有K1E啟動子的載體還包含熒光素酶HiBiT標簽序列。