[發(fā)明專利]一種嗅前體細(xì)胞的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011143985.5
• 申請日: 2020-10-23
• 公開（公告）號: CN112239747A
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃紅云;高文勇;劉瑩
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市虹天濟(jì)神經(jīng)科學(xué)研究院
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;C12N5/0797
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

本發(fā)明提供一種嗅前體細(xì)胞的制備方法。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的嗅前體細(xì)胞，其中所述嗅前體細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞可連續(xù)傳11代以上。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的嗅前體細(xì)胞制備方法效果優(yōu)良，可獲得大量的嗅前體細(xì)胞，而且簡單易行，成本低，安全性好，在國內(nèi)外具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種嗅前體細(xì)胞的制備方法。

背景技術(shù)

嗅前體細(xì)胞也稱嗅神經(jīng)前體細(xì)胞(ONPs)，起源于嗅基底膜，分布在嗅球和嗅粘膜。因可分化為嗅鞘細(xì)胞和嗅神經(jīng)元，其屬于外胚層的一類神經(jīng)祖前體細(xì)胞，具有自我更新和定向分化發(fā)育的潛能，可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、軸突生長刺激物質(zhì)，能促進(jìn)軸突的再生和髓鞘的形成，而這些因子都能支持軸突的延伸，具有神經(jīng)營養(yǎng)、保護(hù)、免疫調(diào)控或刺激、抑制膠質(zhì)增生及瘢痕形成、促髓鞘化和軸突再生等綜合神經(jīng)修復(fù)作用。嗅前體細(xì)胞這些特性可為損傷神經(jīng)修復(fù)及功能恢復(fù)建立很好的內(nèi)環(huán)境，使其成為治療中樞神經(jīng)疾病和損傷的理想候選細(xì)胞，在臨床上具備廣泛的應(yīng)用前景。

因此，當(dāng)前如何對嗅前體細(xì)胞進(jìn)行安全和有效的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增對其廣泛用于基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究中具有重要的影響。然而，現(xiàn)有技術(shù)中國內(nèi)外嗅前體細(xì)胞研究方面尚存有以下缺陷：

1.制備嗅前體細(xì)胞時(shí)，組織標(biāo)本取材部位差異大，同時(shí)增加成纖維細(xì)胞和造血干細(xì)胞污染的機(jī)會(huì)。

2.當(dāng)前的制備方法多使用酶解法消化組織，限制了原代嗅前體細(xì)胞的獲取量、純度等。

3.當(dāng)前的制備方法中培養(yǎng)基的選擇限制了獲得嗅前體細(xì)胞的擴(kuò)增效率和獲得的細(xì)胞純度。

4.當(dāng)前的制備方法中，嗅前體細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方式及傳代次數(shù)影響了得到的嗅前體細(xì)胞的存活狀態(tài)和純度。

基于以上，當(dāng)前對新的嗅前體細(xì)胞的制備方法存在迫切需求。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種嗅前體細(xì)胞的制備方法，本發(fā)明提供的方法能在體外培養(yǎng)并高效擴(kuò)增嗅前體細(xì)胞，從而獲得高純度的嗅前體細(xì)胞。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的制備方法優(yōu)化了嗅前體細(xì)胞的取材部位和對組織的處理方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法突破了當(dāng)前的技術(shù)中關(guān)于傳代和純度的技術(shù)瓶頸，在國內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用研究中潛力巨大，擁有廣泛應(yīng)用前景，為臨床用細(xì)胞研究提供有力的保障。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一方面，本發(fā)明提供了一種嗅前體細(xì)胞的制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)取上鼻甲和中鼻甲之間處的嗅粘膜組織，并進(jìn)行無菌處理；

(2)在36-38℃下，使用1-2倍體積的濃度為5％(g/100mL)的胰蛋白酶和1-2倍體積的濃度為0.2mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液預(yù)處理步驟(1)得到的嗅粘膜組織塊5-15分鐘；

(3)去除經(jīng)步驟(2)預(yù)處理后的嗅粘膜組織塊的表膜和底膜松動(dòng)層，并用磷酸緩沖溶液(PBS)沖洗2-5次，并制備為0.5-1.5mm³的小塊；

(4)使用嗅前體細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟(3)處理后的小塊，使其貼壁生長；

其中，所述嗅前體細(xì)胞培養(yǎng)基包含以下組分：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/DF12、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、N2細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、B27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、牛血清白蛋白(BSA)、谷氨酰胺和NEAA細(xì)胞培養(yǎng)添加劑；

(5)當(dāng)貼壁生長的細(xì)胞生長融合率達(dá)到75％-90％，收集單細(xì)胞，并加入嗅前體細(xì)胞培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液，得到所述嗅前體細(xì)胞；

其中，上述操作均在嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行。