[發明專利]一種嗅前體細胞的制備方法

在審

• 申請號: 202011143985.5
• 申請日: 2020-10-23
• 公開（公告）號: CN112239747A
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發明（設計）人: 黃紅云;高文勇;劉瑩
• 申請（專利權）人: 北京市虹天濟神經科學研究院
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;C12N5/0797
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

1.一種嗅前體細胞的制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)取上鼻甲和中鼻甲之間處的嗅粘膜組織，并進行無菌處理；

(2)在36-38℃下，使用1-2倍體積的濃度為5％(g/100mL)的胰蛋白酶和1-2倍體積的濃度為0.2mmol/L的EDTA水溶液預處理步驟(1)得到的嗅粘膜組織塊5-15分鐘；

(3)去除經步驟(2)預處理后的嗅粘膜組織塊的表膜和底膜松動層，并用PBS沖洗2-5次，并制備為0.5-1.5mm³的小塊；

(4)使用嗅前體細胞培養基培養步驟(3)處理后的小塊，使其貼壁生長；

其中，所述嗅前體細胞培養基包含以下組分：

基礎培養基DMEM/DF12、表皮細胞生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、N2細胞培養添加劑、B27細胞培養添加劑、牛血清白蛋白(BSA)、谷氨酰胺和NEAA細胞培養添加劑；

(5)當貼壁生長的細胞生長融合率達到75％-90％，收集單細胞，并加入嗅前體細胞培養基制備成細胞懸液，得到所述嗅前體細胞；

其中，上述操作均在嚴格無菌條件下進行。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其中在步驟(1)中，使用標本組織咬鉗取供者上鼻甲和中鼻甲之間處的嗅粘膜組織，并將取得的鼻粘膜組織塊放入冰盒中。

3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其中在步驟(3)中，所述方法還包括以下步驟：

將小塊制備為0.2-0.4mm³的小小塊，并使用含有160U/mL的慶大霉素的嗅前體細胞培養基反復洗滌小小塊；

優選地，所述方法包括以下步驟：

將小塊置于加有160U/mL的慶大霉素的嗅前體細胞培養基中，反復沖洗，用眼科組織鑷撕成0.2-0.4mm³左右，收集小小塊置于離心管內，離心機轉速為800-2100轉/分鐘，離心10-30分鐘，棄掉上清；重新加入含160U/mL的慶大霉素的嗅前體細胞培養基，將沉淀的組織塊充分振蕩，使之松散，再次離心10-30分鐘，離心機轉速為800-2100轉/分鐘。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的制備方法，其中在步驟(4)中，在細胞培養前，使用血清原液潤濕培養裝置；

優選地，在步驟(4)中，所述培養條件為避光、37℃、5％的CO₂。

5.根據權利要求1至4中任一項所述的制備方法，其中在步驟(4)中，所述嗅前體細胞培養基包含以下組分：

90mL的DMEM/DF12、80mg EGF、60mgFGF、2mL 1％的N2細胞培養添加劑、3mL 2％的B27細胞培養添加劑、150mg BSA、0.2mmol/mL谷氨酰胺、2mL NEAA細胞培養添加劑；

優選地，所述嗅前體細胞培養基還包含以下組分：

5-20μmol/L的P63、P53抑制劑Pifithrin-αhydrobromide或Pifithrin-μ；

或1-10μmol/L的P63、P53激動劑PRIMA-1Met/Tenovin-1。

6.根據權利要求1至5中任一項所述的制備方法，其中，在步驟(4)中和步驟(5)中，每三天更換一次嗅前體細胞培養基。

7.根據權利要求1至6中任一項所述的制備方法，其中，在步驟(4)中，當貼壁生長的細胞生長融合率在55％-85％時，收集小塊，并轉移到新的培養裝置中重復培養；

優選地，所述小塊重復使用5-7次，以制備5-7批嗅前體細胞。

8.根據權利要求1至7中任一項所述的制備方法，其中，在步驟(5)中，所述收集單細胞包括以下步驟：

使用DMEM/F12溶液沖洗培養裝置，用0.05％胰蛋白酶和0.2mmol/L EDTA水溶液使貼壁的單個細胞脫落，離心收集單細胞，加入嗅前體細胞培養基制成細胞懸液；

優選地，所述單細胞懸液的細胞密度為1×10⁵/mL-1×10⁶/mL。

9.根據權利要求1至8中任一項所述的制備方法，其中，在步驟(5)中，所述嗅前體細胞每2-3天傳代一次，進行1-3代傳代培養。