[發(fā)明專利]一種增加人甲狀腺過氧化物酶產(chǎn)量的試劑和表達(dá)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011142206.X
• 申請(qǐng)日: 2020-10-22
• 公開（公告）號(hào): CN112501141A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 易維京;馮奇;曹莎莎;李乾;付鵬德;張麗華;姬成東;趙忠顥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶中元匯吉生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/08
• 分類號(hào): C12N9/08;C12N15/67;C12N15/866
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及蛋白表達(dá)技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種增加人甲狀腺過氧化物酶產(chǎn)量的試劑和表達(dá)方法，利用信號(hào)肽標(biāo)記的TPO基因和分子伴侶的共表達(dá)作用，篩選出高表達(dá)，高性能的TPO，可以廣泛的用于臨床實(shí)驗(yàn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白表達(dá)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種增加人甲狀腺過氧化物酶產(chǎn)量試劑和的表達(dá)方法。

背景技術(shù)

甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)是一種含有血紅素輔基的膜結(jié)合糖蛋白，整個(gè)分子分為膜內(nèi)區(qū)，跨膜區(qū)和膜外區(qū)，cDNA全長3kb，跨膜區(qū)的存在使TPO在表達(dá)時(shí)難以分泌出來。

自身免疫性甲狀腺疾病(Autoimmune thyroid diseases，AITD)是由T細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異自身免疫性疾病，患者血清內(nèi)存在多種針對(duì)甲狀腺抗原的自身抗體，甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPO-Ab)就是其中最重要的一種，普遍存在于自身免疫性甲狀腺疾病中，血清中甲狀腺過氧化物酶抗體水平的測定，是對(duì)自身免疫性甲狀腺疾病高危人群篩查、診斷和治療的有效手段。因此，TPO-Ab水平的檢測可用于對(duì)甲減、AITD等甲狀腺疾病的診斷、病程進(jìn)展、用藥和愈后觀察；且TPO-Ab的測定還可作為Graves病、橋本甲亢等診斷和鑒別診斷的首選指標(biāo)，因此表達(dá)量高、性能優(yōu)良的TPO蛋白，對(duì)于制作高效、低成本的甲狀腺疾病檢測試劑盒的開發(fā)顯得尤為重要。

目前，國內(nèi)外所用的抗原都來自進(jìn)口，成本較高，且較難訂貨，現(xiàn)有技術(shù)多用傳統(tǒng)桿狀病毒制備重組TPO，再導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，但往往存在表達(dá)量低、折疊不充分的問題，會(huì)影響后續(xù)檢測陽性率，難以用于臨床檢測。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決TPO在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)量低、折疊不充分，影響后續(xù)檢測陽性率的問題，本文介紹一種可以滿足市場需求的高產(chǎn)量、高質(zhì)量和低成本的方案。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)手段：

一種增加人甲狀腺過氧化物酶表達(dá)產(chǎn)量的試劑，包括信號(hào)肽和分子伴侶。

優(yōu)選地，所述信號(hào)肽包括Pepidyl glycine alphaamidatingmonooxygenase(PAM，SEQ ID NO：1)、DBip(SEQ ID NO：2)、Melittin(SEQ ID NO：3)和GP64(SEQ ID NO：4)。

優(yōu)選地，所述分子伴侶為Bip(SEQ ID NO：8)、PDI(SEQ ID NO：9)、Calnexin(SEQID NO：10) 或HSP70(SEQ ID NO：11)中的一種或幾種。

更優(yōu)選地，所述分子伴侶為Calnexin。

本發(fā)明的另一方面提供了一種增加人甲狀腺過氧化物酶表達(dá)產(chǎn)量的方法，包括

A、信號(hào)肽標(biāo)記的TPO轉(zhuǎn)入病毒細(xì)胞，制作TPO病毒；

B、分子伴侶轉(zhuǎn)入病毒細(xì)胞，制作分子伴侶病毒；

C、將步驟A所述的TPO病毒和步驟B所述的分子伴侶病毒導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，得TPO蛋白。

可選地，所述步驟A之前可以包括信號(hào)肽的篩選過程，即將N端添加信號(hào)肽的TPO基因構(gòu)建到載體中，轉(zhuǎn)入DH10bac細(xì)菌中進(jìn)行藍(lán)白班篩選和PCR驗(yàn)證，提取正確細(xì)胞的bacmid質(zhì)粒。所述信號(hào)肽篩選之后，將正確細(xì)胞的bacmid質(zhì)粒，即信號(hào)肽標(biāo)記的TPO，轉(zhuǎn)入病毒細(xì)胞進(jìn)行TPO病毒制作。

上述信號(hào)肽的篩選過程可以確保TPO蛋白順利表達(dá)，并篩選表達(dá)量最高的信號(hào)肽進(jìn)行步驟A。

優(yōu)選地，所述步驟B分子伴侶病毒的制作具體過程為，合成分子伴侶序列并將其構(gòu)建到載體中，轉(zhuǎn)入DH10bac細(xì)菌中進(jìn)行藍(lán)白班篩選和PCR驗(yàn)證，提取正確細(xì)胞的bacmid質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入病毒細(xì)胞進(jìn)行分子伴侶病毒制作。