[發明專利]一種病原微生物檢測用測序文庫的構建方法

在審

• 申請號: 202011138869.4
• 申請日: 2020-10-22
• 公開（公告）號: CN112011835A
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 曾志鵬;張鵬;邢寬;謝珍;何志健;何貴倫;安雪茹;張艷英
• 申請（專利權）人: 南京實踐醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 南京瑞華騰知識產權代理事務所(普通合伙) 32368
• 代理人: 梁金娟

本發明公開了一種病原微生物檢測用測序文庫的構建方法，包括S1，從樣本中提取得到DNA和RNA，對RNA進行逆轉錄；S2，往步驟S1中加入二鏈合成反應液和二鏈合成酶，使RNA/cDNA復合雙鏈形成雙鏈cDNA；S3，純化；S4，在S3得到的純化產物中加入DNA打斷修復反應液和DNA打斷修復酶混合物，對產物同時進行片段化、末端修復和加A尾；S5，不純化，向上述片段化的溶液中直接加入接頭、接頭反應液和連接酶進行接頭連接，得接頭連接產物；S6，純化；S7，文庫擴增；S8，純化S7中的擴增產物得到原始DNA/RNA可測序的文庫。本發明耗時短；對RNA一鏈合成和二鏈合成時，只對RNA起作用，不干擾體系中存在的DNA，待RNA轉成雙鏈cDNA后與雙鏈DNA一起片段化，真正做到了一個流程實現共建庫的效果。

技術領域

本發明屬于高通量測序技術領域，具體涉及一種病原微生物檢測用測序文庫的構建方法。

背景技術

感染性疾病多為細菌、病毒和真菌等病原微生物及其產物所引起的局部或全身性炎癥或器官功能障礙，具有較大的危害性和較高的病死率。目前，全球感染性疾病的發病率有所上升，病原微生物呈現多樣化和復雜化的發展趨勢。重癥急性呼吸綜合征(SARS)、新型冠狀病毒肺炎(NCP)、新變異型克雅病、H7N9 禽流感等新發感染性疾病不斷出現。而HIV、多重或廣譜耐藥的結核分枝桿菌、沙眼支原體等經典感染性疾病病原微生物又死灰復燃或出現新的致病特征。各種新發和再發的感染性疾病、不易發現的多重感染以及不明病因的發熱等，都給人類健康帶來了巨大的威脅，因此，臨床上對感染性疾病診斷的準確性和時效性提出了更高的要求。

快速、準確的診斷是有效治療、病情監測和控制疾病蔓延的重要前提。隨著分子檢測技術的不斷發展和完善，分子檢測在病原微生物感染診斷及治療監測上的臨床應用日益廣泛，已成為一些重要的感染性疾病的診斷和療效評價中不可缺少的重要工具。目前常用的病原微生物分子檢測方法主要包括：基于PCR的電泳法、實時熒光定量PCR（QPCR）、數字PCR、基因芯片技術、測序技術（Sanger測序技術、焦磷酸測序技術、高通量測序技術）等。

在感染性疾病領域中，獲得病原微生物的活體（對于細菌、真菌、病毒而言，主要是培養陽性），是感染性疾病診斷的金標準，但病原微生物的體外培養耗時普遍較長，操作步驟繁瑣，且絕大多數病原微生物不可培養；免疫學方法（如補體結合試驗、中和試驗、酶聯免疫吸附實驗、免疫熒光法和酶標斑點免疫法等）操作簡單，但由于病原微生物種類繁多，已研發的抗原、抗體數量遠遠不能滿足市場需求；PCR檢測具有極高的靈敏度和特異性，但無法完成高通量篩查，檢出率較低；基因芯片技術只能對已知的病原微生物基因組進行意向性篩查，而無法檢測新的未知病原微生物。據統計，約70%的感染性疾病患者因傳統檢測方法無法確定病原微生物信息，不能得到及時有效地救治，從而使病情惡化。因此，快速、特異且高通量的病原微生物檢測方法，對有效診斷和及時防治感染性疾病具有重要的意義。

近年來快速發展的NGS技術因其不依賴于已知核酸序列，無需特殊探針設計，可直接對未知病原微生物進行檢測，打破了傳統微生物檢驗的局限性，在臨床微生物領域展現了廣闊的前景。

對于病原微生物的檢測，目前NGS的建庫流程為：1.DNA打斷（物理法或者酶法）；2.RNA打斷；3.RNA逆轉錄一鏈合成；4.cDNA二鏈合成；5.二鏈cDNA純化；6.打斷的DNA與二鏈cDNA混合；7.DNA與cDNA末端修復；8.3’末端加尾；9.純化；10.接頭連接；11.純化；12.PCR文庫擴增；13.文庫純化。整個流程（如圖1）需要8個小時左右的時間。病原微生物造成的感染往往發病很快，且病原微生物在體內生長繁殖很快，因此需要更快的檢測方法，而該方法流程較長，步驟較多，操作時間過長，無法滿足醫護人員和患者對報告時效性的要求。現有流程對樣本起始量也高，一般要求大于100ng。由于感染樣本往往來源于胸腹水、肺泡灌洗液、腦脊液和血液等復雜樣本，提取得到的核酸質量不高，微生物含量低，往往達不到建庫要求。而且，DNA和RNA分開兩個流程操作，流程多，純化也多，造成樣本大量損失。