[發明專利]一種病原微生物檢測用測序文庫的構建方法

在審

• 申請號: 202011138869.4
• 申請日: 2020-10-22
• 公開（公告）號: CN112011835A
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 曾志鵬;張鵬;邢寬;謝珍;何志健;何貴倫;安雪茹;張艷英
• 申請（專利權）人: 南京實踐醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 南京瑞華騰知識產權代理事務所(普通合伙) 32368
• 代理人: 梁金娟

1.一種病原微生物檢測用測序文庫的構建方法，其特征在于：按照先后順序包括以下步驟：

S1，從樣本中提取得到DNA和RNA，共投入到一鏈合成反應液和一鏈合成酶中，對RNA進行逆轉錄，使RNA形成RNA/cDNA復合雙鏈，在RNA逆轉錄的條件為溫度不超過65℃，其時間不超過15min；

S2，往步驟S1中加入二鏈合成反應液和二鏈合成酶，使RNA/cDNA復合雙鏈形成雙鏈cDNA；

S3，純化上述步驟中的雙鏈cDNA和雙鏈DNA的混合物；

S4，在S3得到的純化產物中加入DNA打斷修復反應液和DNA打斷修復酶混合物，對產物同時進行片段化、末端修復和加A尾；

S5，不純化，向上述片段化的溶液中直接加入接頭、接頭反應液和連接酶進行接頭連接，得接頭連接產物；

S6，接著純化接頭連接產物；

S7，文庫擴增：步驟S6所得產物中加入擴增酶混合液和引物，進行PCR擴增；

S8，純化S7中的擴增產物即可以得到原始DNA/RNA可測序的文庫。

2.根據權利要求1所述的一種病原微生物檢測用測序文庫的構建方法，其特征在于：所述步驟S1中的所述樣本為鼻咽拭子、口腔拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、腦脊液、血清、血漿、血液、尿液或糞便。

3.根據權利要求1所述的一種病原微生物檢測用測序文庫的構建方法，其特征在于：所述步驟S1中的所述一鏈合成反應液包括：Tris-HCl 20-70mM、KCl 50-100mM、MgCl₂ 1-10mM、DTT 5-20mM、dNTP 20-100μM、RNase Inhibitor 1-10U、Random Primer 0.5-5μM。

4.根據權利要求1所述的一種病原微生物檢測用測序文庫的構建方法，其特征在于：所述步驟S1中的所述一鏈合成酶為具有逆轉錄活性的酶。

5.根據權利要求1所述的一種病原微生物檢測用測序文庫的構建方法，其特征在于：所述步驟S2中的所述二鏈合成反應液包括：Tris-HCl 30-100mM、KCl 50-100mM、MgCl₂ 1-10mM、DTT 5-20mM、dNTP 20-100μM、dATP 20-100μM。

6.根據權利要求1所述的一種病原微生物檢測用測序文庫的構建方法，其特征在于：所述步驟S2中的所述二鏈合成酶包括：Klenow片段0.01-0.05 U/μL、RNase H 0.01-0.1U/μL。

7.根據權利要求1所述的一種病原微生物檢測用測序文庫的構建方法，其特征在于：所述步驟S3中所述雙鏈cDNA和雙鏈DNA的混合物為0.1-100ng。

8.根據權利要求1所述的一種病原微生物檢測用測序文庫的構建方法，其特征在于：所述步驟S4中所述DNA打斷修復反應液包括：Tris-HCl 10-50mM、MgCl₂ 10-50mM、DTT 1-10mM、dNTP 20-100μM、dATP 0.2-1mM、NaCl 20-80mM、BSA 0.1-1 mg/ml、TritonX-1000.1%-0.5%。