[發明專利]擴增NK細胞并增強其殺傷活性的因子、飼養細胞系及方法

在審

• 申請號: 202011138505.6
• 申請日: 2020-10-22
• 公開（公告）號: CN112266413A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 郭猛;劉艷芳;孫晨;錢煜平;鄭星;郭辰曦
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍海軍軍醫大學
• 主分類號: C07K14/55
• 分類號: C07K14/55;C12N5/10;C12N5/0783;C12N15/867;A61K35/17;A61P35/00;C12R1/91
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 孫躍虹

本發明涉及生物醫藥技術領域，提供了白細胞介素?2擬似物SIL?2、適用于NK細胞體外擴增的飼養細胞系及其構建，以及提升NK細胞增殖活性與殺傷活性的方法。飼養層細胞分泌的IL?2擬似物相較于天然IL?2具有更高的白細胞介素2受體βγ(IL?2βγ)的親和力，在千皮克/mL濃度下即可維持NK細胞的增殖活性；該IL?2擬似物可以促進NK細胞表面OX40的表達，并形成OX40?OX40L正反饋環，促進NK細胞的增殖與細胞毒活性。本發明實現了NK的無細胞因子的規模化擴增，在21天的擴增周期中實現2000倍以上的擴增效率，擴增細胞對淋巴瘤、肝細胞肝癌、卵巢癌等多種腫瘤具有顯著的體內殺傷活性，為腫瘤的NK過繼性免疫治療提供了一種有效且低成本的的擴增方法，并可顯著提高擴增NK的殺傷活性。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及過繼性免疫治療，具體涉及一種促進NK細胞增殖的白細胞介素-2擬似物SIL-2、新型飼養細胞及其構建、提升NK細胞增殖活性與殺傷活性的方法，培養體系中無需添加細胞因子即可實現NK細胞的高效擴增。

背景技術

自然殺傷細胞(natural killer cell,NK細胞)由骨髓淋巴樣干細胞分化而來，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴結。不同于T細胞，NK細胞無需預先致敏就能非特異性殺傷腫瘤細胞和病毒感染細胞的淋巴細胞。最初，NK細胞靶向殺傷腫瘤的證據來自同種異體造血干細胞移植(HSCT)治療急性髓性白血病(AML)。NK細胞是HSCT后首先恢復的淋巴細胞群，其中供體來源的同種異體反應性NK細胞(至少一個KIR/HLA與受體錯配)，可以產生移植物抗白血病(GvL)效果并防治腫瘤復發。HSCT后NK細胞的快速恢復對AML患者的臨床預后具有積極意義，移植后30天NK細胞計數可作為移植預后的單一獨立積極因素。因此過繼性回輸NK細胞是一種極具前途的腫瘤免疫治療手段。

NK細胞在大多數人中僅構成總外周淋巴細胞的很小一部分(5％～25％)，且成熟NK細胞壽命較短(7～12天)，因此如何通過體外培養擴增，獲取足夠數量的細胞成為NK細胞過繼療法的關鍵技術瓶頸。

此前，已有許多研究團隊致力于開發NK細胞體外擴增的技術，以獲得滿足治療需求的NK細胞數量。目前已經報道了數十種NK細胞的擴增方法，有少量方案是成功的，實現了超過千倍的擴增，而大部分方法只能產生很少的擴增(幾十到數百倍)。有多種因素都可能導致擴增失敗難以獲得足夠的細胞量：內在因素是NK細胞譜系的變異、細胞條件或供體細胞的生物學活性差異，健康的年青供體NK細胞可能更傾向于擴增，而高齡供體和晚期腫瘤供體的NK細胞則難以在體外培養中存活；外在因素主要是培養條件(培養基，細胞因子，飼養細胞)和培養持續時間。

研究表明細胞因子對于NK細胞的存活和增殖至關重要，并且參與維持擴增后NK細胞殺傷活性。目前細胞因子如IL-2、IL-15、IL-21等已被用于體外擴增NK細胞，但IL-2的使用會引起免疫抑制亞群Treg細胞擴增，混有Treg細胞可能會削弱NK細胞的殺傷活性，促進腫瘤免疫逃逸；使用其他細胞因子如IL-15、IL-21替代IL-2雖然可以減少Treg的擴增，但會誘導NK細胞負調控免疫檢查點分子NKG2A的表達，導致回輸的細胞容易發生耗竭，無法在腫瘤內有效發揮殺傷活性。此外，無論是IL-2還是IL-15/21，均與IL-2Rβγ表現為中等親和力，必須在培養周期中反復多次補充細胞因子維持有效濃度，極大提高了NK細胞擴增的成本。

在培養體系中使用基因修飾過的飼養細胞是當前最有有效的NK細胞擴增活化手段。最常見的飼養細胞是基因修飾的K562細胞，可通過基因工程改造的方法使其膜表面表達刺激分子和/或膜綁定的細胞因子來激活并擴增NK細胞，效果要優于單獨使用可溶性細胞因子。