[發(fā)明專利]擴(kuò)增NK細(xì)胞并增強(qiáng)其殺傷活性的因子、飼養(yǎng)細(xì)胞系及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011138505.6
• 申請(qǐng)日: 2020-10-22
• 公開（公告）號(hào): CN112266413A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭猛;劉艷芳;孫晨;錢煜平;鄭星;郭辰曦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/55
• 分類號(hào): C07K14/55;C12N5/10;C12N5/0783;C12N15/867;A61K35/17;A61P35/00;C12R1/91
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 孫躍虹

1.一種白細(xì)胞介素-2擬似物SIL-2，其特征在于，SIL-2的氨基酸序列如Seq ID NO.2、Seq ID NO.3以及Seq ID NO.4任一項(xiàng)所示。

2.一種適用于NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的飼養(yǎng)細(xì)胞系，其特征在于，該飼養(yǎng)細(xì)胞系以NK-92作為載體細(xì)胞，能夠自分泌權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞介素-2擬似物SIL-2，且細(xì)胞表面表達(dá)NK細(xì)胞活化受體的配體分子胞外段。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的適用于NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的飼養(yǎng)細(xì)胞系，其特征在于，

其中，所述配體分子胞外段為4-1BBL或OX40L，

4-1BBL的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，OX40L的氨基酸序列如Seq ID NO.6所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的適用于NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的飼養(yǎng)細(xì)胞系，其特征在于，

其中，所述配體分子胞外段為4-1BBL或OX40L，以GPI錨定的方式實(shí)現(xiàn)膜綁定，

4-1BBL的氨基酸序列如Seq ID NO.10所示，OX40L的氨基酸序列如Seq ID NO.11所示，GPI的氨基酸序列如Seq ID NO.7、Seq ID NO.8以及Seq ID NO.9任一項(xiàng)所示。

5.權(quán)利要求2～4任一項(xiàng)所述的適用于NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的飼養(yǎng)細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

A、設(shè)計(jì)基因元件

根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)擬似物SIL-2、配體分子胞外段4-1BBL或OX40L、以及GPI基因片段，

B、慢病毒載體構(gòu)建

將擬似物SIL-2基因片段、配體分子胞外段片段或配體分子胞外段及GPI基因片段克隆慢病毒載體；采用慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染lenti-X-293細(xì)胞后，收集病毒上清液；上清液于4℃、20000rpm、離心2.5小時(shí)后，收集病毒顆粒，使用50μL～100μLPBS重懸病毒，

C、飼養(yǎng)細(xì)胞的建系

復(fù)蘇低代次NK92細(xì)胞，傳代3～4次，細(xì)胞倍增時(shí)間＜20小時(shí)后能夠使用；1×10⁵/孔鋪24孔板，37℃，5％CO₂培養(yǎng)2～4小時(shí)，每孔加入2mg/mL聚凝胺，充分混勻后，按MOI＝20加入包被好的病毒；侵染12hrs后，吸取全部細(xì)胞液，轉(zhuǎn)移至含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至第四天，F(xiàn)ACS檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比例并進(jìn)行分選；分選后的細(xì)胞增殖到10⁷以上后分單克隆；待單克隆生長(zhǎng)至10⁷數(shù)量以上后，檢測(cè)其細(xì)胞因子或共刺激分子表達(dá)，篩選出表達(dá)豐度最高的克隆，完成建系。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的適用于NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的飼養(yǎng)細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于：

其中，步驟C中，培養(yǎng)瓶中，完全培養(yǎng)基的體積與培養(yǎng)瓶容積之間的比例為3/10～2/5。

7.一種提升NK細(xì)胞增殖活性與殺傷活性的方法，其特征在于：以NK-92作為載體細(xì)胞，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建成遺傳性狀穩(wěn)定的飼養(yǎng)細(xì)胞；能夠自分泌細(xì)胞因子IL-2或IL-2擬似物SIL-2，維持培養(yǎng)體系中NK細(xì)胞的增殖活性；細(xì)胞表面以GPI錨定的方式表達(dá)NK活化受體的配體分子胞外段4-1BBL或OX40L。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的提升NK細(xì)胞增殖活性與殺傷活性的方法，其特征在于：

其中，當(dāng)配體分子胞外段為OX40L時(shí)，形成有OX40-OX40L正反饋環(huán)。

9.經(jīng)權(quán)利要求2～4任一項(xiàng)所述的飼養(yǎng)細(xì)胞系擴(kuò)增的NK細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的用途。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述抗腫瘤藥物為殺傷HepG2體內(nèi)原位腫瘤、A427體內(nèi)原位腫瘤或殺傷CAVO3體內(nèi)原位腫瘤的藥物。