[發明專利]擴增NK細胞并增強其殺傷活性的因子、飼養細胞系及方法

在審

• 申請號: 202011138505.6
• 申請日: 2020-10-22
• 公開（公告）號: CN112266413A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 郭猛;劉艷芳;孫晨;錢煜平;鄭星;郭辰曦
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍海軍軍醫大學
• 主分類號: C07K14/55
• 分類號: C07K14/55;C12N5/10;C12N5/0783;C12N15/867;A61K35/17;A61P35/00;C12R1/91
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 孫躍虹

1.一種白細胞介素-2擬似物SIL-2，其特征在于，SIL-2的氨基酸序列如Seq ID NO.2、Seq ID NO.3以及Seq ID NO.4任一項所示。

2.一種適用于NK細胞體外擴增的飼養細胞系，其特征在于，該飼養細胞系以NK-92作為載體細胞，能夠自分泌權利要求1所述的白細胞介素-2擬似物SIL-2，且細胞表面表達NK細胞活化受體的配體分子胞外段。

3.根據權利要求2所述的適用于NK細胞體外擴增的飼養細胞系，其特征在于，

其中，所述配體分子胞外段為4-1BBL或OX40L，

4-1BBL的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，OX40L的氨基酸序列如Seq ID NO.6所示。

4.根據權利要求2所述的適用于NK細胞體外擴增的飼養細胞系，其特征在于，

其中，所述配體分子胞外段為4-1BBL或OX40L，以GPI錨定的方式實現膜綁定，

4-1BBL的氨基酸序列如Seq ID NO.10所示，OX40L的氨基酸序列如Seq ID NO.11所示，GPI的氨基酸序列如Seq ID NO.7、Seq ID NO.8以及Seq ID NO.9任一項所示。

5.權利要求2～4任一項所述的適用于NK細胞體外擴增的飼養細胞系的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

A、設計基因元件

根據氨基酸序列設計擬似物SIL-2、配體分子胞外段4-1BBL或OX40L、以及GPI基因片段，

B、慢病毒載體構建

將擬似物SIL-2基因片段、配體分子胞外段片段或配體分子胞外段及GPI基因片段克隆慢病毒載體；采用慢病毒包裝質粒轉染lenti-X-293細胞后，收集病毒上清液；上清液于4℃、20000rpm、離心2.5小時后，收集病毒顆粒，使用50μL～100μLPBS重懸病毒，

C、飼養細胞的建系

復蘇低代次NK92細胞，傳代3～4次，細胞倍增時間＜20小時后能夠使用；1×10⁵/孔鋪24孔板，37℃，5％CO₂培養2～4小時，每孔加入2mg/mL聚凝胺，充分混勻后，按MOI＝20加入包被好的病毒；侵染12hrs后，吸取全部細胞液，轉移至含有完全培養基的培養瓶中，培養至第四天，FACS檢測陽性細胞比例并進行分選；分選后的細胞增殖到10⁷以上后分單克隆；待單克隆生長至10⁷數量以上后，檢測其細胞因子或共刺激分子表達，篩選出表達豐度最高的克隆，完成建系。

6.根據權利要求5所述的適用于NK細胞體外擴增的飼養細胞系的構建方法，其特征在于：

其中，步驟C中，培養瓶中，完全培養基的體積與培養瓶容積之間的比例為3/10～2/5。

7.一種提升NK細胞增殖活性與殺傷活性的方法，其特征在于：以NK-92作為載體細胞，通過慢病毒轉染構建成遺傳性狀穩定的飼養細胞；能夠自分泌細胞因子IL-2或IL-2擬似物SIL-2，維持培養體系中NK細胞的增殖活性；細胞表面以GPI錨定的方式表達NK活化受體的配體分子胞外段4-1BBL或OX40L。

8.根據權利要求7所述的提升NK細胞增殖活性與殺傷活性的方法，其特征在于：

其中，當配體分子胞外段為OX40L時，形成有OX40-OX40L正反饋環。

9.經權利要求2～4任一項所述的飼養細胞系擴增的NK細胞在制備抗腫瘤藥物中的用途。

10.根據權利要求9所述的用途，其特征在于，所述抗腫瘤藥物為殺傷HepG2體內原位腫瘤、A427體內原位腫瘤或殺傷CAVO3體內原位腫瘤的藥物。