[發明專利]誘導多能干細胞分化制備心臟瓣膜內皮細胞的方法及其應用

有效

• 申請號: 202011138257.5
• 申請日: 2020-10-22
• 公開（公告）號: CN112359012B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 孫玉華;程麟茜;董念國
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所;華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 劉琳

本發明公開了一種誘導多能干細胞分化制備心臟瓣膜內皮細胞的方法及其應用，該方法首先將多能干細胞平鋪種植在基質膠包被的培養皿中用Essencial 8培養使其貼壁；將多能干細胞細胞置于含有Wnt3a和骨形態發生蛋白4的分化培養基Essencial 6中培養，再置于含有表皮生長因子和骨形態發生蛋白4分化培養基Essencial 6中培養，將心臟中胚層細胞消化，再將上述培養皿中心臟中胚層細胞置于含有骨形態發生蛋白4、轉化生長因子和內皮生長因子的分化培養基Essencial 6中連續培養；得到心臟瓣膜內皮細胞；本發明的方法分化效率高，在不經過流式分選的情況下，能夠得到80％以上的瓣膜內皮細胞，因而可以保證充足的種子細胞來源。

技術領域

本發明涉及干細胞分化領域，具體涉及一種誘導多能干細胞分化制備心臟瓣膜內皮細胞的方法及其應用。

背景技術

在心臟搏動期間，血流從低壓力的心房流到高壓力的心室,并最終供應到全身的主要動脈。心臟瓣膜在其中起到單向閥門的作用，維持血液的單向流動。當心臟收縮時，連結左心房和左心室的二尖瓣和連結右心房和右心室的三尖瓣可防止血液從心室回流到心房；當心臟舒張時，連結左心室和主動脈的主動脈瓣、連結右心室和肺動脈的肺動脈瓣可防止血液從動脈向心室的逆流。從而保證心跳的正常進行。

當閥門無法正常打開(狹窄)或未完全關閉(回流)時，就會發生閥門故障，造成心臟瓣膜疾病，如：瓣膜狹窄，瓣膜關閉不全等。根據報導，狹窄的瓣膜會影響瓣膜周邊力學環境，產生渦流，使血液無法正常流動，血細胞在此不均勻附著，易產生血栓，同時破壞了瓣膜的表面結構；而瓣膜關閉不全，會導致血液大量高速的反流，沖擊和破壞瓣葉，從而加劇瓣膜疾病(施德昆，2014)。

心臟瓣膜疾病是全球疾病和死亡的重要原因。根據2010年美國心血管協會發布的數據，每年由于瓣膜疾病引起的死亡人數大約為 20000，美國主動脈瓣疾病的患病率達到了2.5％，在美國每年大約有82000例瓣膜置換手術(Association.，2004)。目前我國尚缺少系統的心臟瓣膜疾病流行性分析的數據，但根據聶靜雨等人的調查報告，在我國35歲以上的人群隨機抽樣中(共28909人)，18.3％患有二尖瓣返流，0.3％患有二尖瓣狹窄，16.4％患有主動脈返流，1.4％患有主動脈狹窄(聶靜雨，2017)。目前在國內心臟病患者中心臟瓣膜病患者約占30％，每年有大量的患者要進行心臟瓣膜置換手術(崔永春et al.，2016)。

常用于手術的人工瓣膜主要是機械瓣和生物瓣，但目前沒有任何瓣膜替代物具有重塑，再生和生長天然結構的潛力(MacGrogan D et al.，2014)。機械瓣耐久性強，但其具有以下缺陷：

(1)組織相容性與抗感染能力均不理想，較易造成血細胞破壞，甚至血栓栓塞等；

(2)術后需長期抗凝治療，而長期應用抗凝劑又容易造成出血并發癥；生物瓣置換術后不需抗凝治療并且血流動力學比機械瓣要好，相對不容易形成血栓，但同樣存在缺陷：

(1)生物瓣容易衰敗，壽命短；

(2)容易發生鈣化，因而生物瓣膜常因毀損面臨再次手術(傅杰et al.，2011)。

理想的解決方案是用細胞包裹組織工程材料，使之既具備生物瓣的優點，同時具備重塑，生長等潛力，從而解決其易衰敗，壽命短等問題。目前市面上已經有多種支架材料用于瓣膜置換手術，但沒有可用的種子細胞進行移植，使組織工程瓣的發展受到掣肘。

造成種子細胞缺乏的原因很多，第一是因為心臟瓣膜細胞較難分離，且難以在體外長期培養，因而細胞數目極為有限，難以達到種子細胞種植的數目要求。第二是因為之前對人心臟瓣膜的研究比較少，因而很難得到心臟瓣膜內皮細胞的類似物。