[發明專利]誘導多能干細胞分化制備心臟瓣膜內皮細胞的方法及其應用

有效

• 申請號: 202011138257.5
• 申請日: 2020-10-22
• 公開（公告）號: CN112359012B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 孫玉華;程麟茜;董念國
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所;華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 劉琳

1.一種誘導多能干細胞分化制備心臟瓣膜內皮細胞的方法，包括以下步驟：

1）將多能干細胞平鋪種植在基質膠包被的培養皿中用Essencial 8培養使其貼壁；其中，多能干細胞平鋪密度為3萬個/cm²；基質膠為geltrex基質膠或matrigel基質膠；

2）將多能干細胞置于含有Wnt3a和骨形態發生蛋白4的分化培養基Essencial 6中培養1天，再置于含有bFGF和骨形態發生蛋白4分化培養基Essencial 6中培養2天，得到心臟中胚層細胞；其中，含有Wnt3a和BMP4的分化培養基Essencial 6中，Wnt3a終濃度為25ng/mL和BMP4濃度為10ng/mL；含有bFGF和骨形態發生蛋白4分化培養基Essencial 6中，bFGF濃度為20ng/mL和骨形態發生蛋白4濃度為50ng/mL；

3）將心臟中胚層細胞消化，再將消化后的心臟中胚層細胞平鋪種植在基質膠包被的培養皿中，使其貼壁；其中，消化后的心臟中胚層細胞平鋪密度為3萬個/cm²；其中，基質膠為geltrex基質膠或matrigel基質膠；

4）再將上述培養皿中心臟中胚層細胞置于含有骨形態發生蛋白4、轉化生長因子TGFβ1和內皮生長因子VEGF的分化培養基Essencial 6中連續培養4~8天；得到心臟瓣膜內皮細胞；其中，含有骨形態發生蛋白4、轉化生長因子TGFβ1和內皮生長因子VEGF的分化培養基Essencial 6中，骨形態發生蛋白4終濃度為5~15ng/mL，轉化生長因子TGFβ1終濃度為5~15ng/mL，內皮生長因子VEGF濃度為90~120ng/mL。

2.根據權利要求1所述誘導多能干細胞分化制備心臟瓣膜內皮細胞的方法，其特征在于：所述步驟4）中，

含有骨形態發生蛋白4、轉化生長因子TGFβ1和內皮生長因子VEGF的分化培養基Essencial 6中，骨形態發生蛋白4終濃度為10ng/mL，轉化生長因子TGFβ1終濃度為10ng/mL，內皮生長因子VEGF濃度為100ng/mL，培養時間為6天。

3.一種權利要求1所述方法制備的心臟瓣膜內皮細胞在制備心臟瓣膜細胞中的應用，其特征在于：所述應用的方法，包括以下步驟：

將心臟瓣膜內皮細胞置于含有bFGF和轉化生長因子TGFβ1的Essential 6培養基培養，培養過程中部分心臟瓣膜內皮細胞會發生內皮間充質轉化，轉化為瓣膜間充質細胞，呈現纖維狀的形態；培養3天后，得到心臟瓣膜細胞，其中，

所述心臟瓣膜細胞由瓣膜間充質細胞和心臟瓣膜內皮細胞組成；含有bFGF和轉化生長因子TGFβ1的Essential 6培養基，bFGF終濃度為10ng/mL和轉化生長因子TGFβ1終濃度為10ng/mL。

4.一種權利要求1所述方法制備得到心臟瓣膜內皮細胞在制作人工心臟瓣膜中的應用。

5.一種權利要求3所述方法制備得到心臟瓣膜細胞在制作人工心臟瓣膜中的應用。