[發(fā)明專利]一種禽畜糞便發(fā)酵菌劑的篩選方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011135489.5
• 申請(qǐng)日: 2020-10-22
• 公開（公告）號(hào): CN112251357A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭強(qiáng);肖建中;丁楓華;張東旭;游張平;黃健;徐飛;張曉青;曾玉榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 麗水學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N1/02
• 分類號(hào): C12N1/02;C12N1/14;C12R1/68
• 代理公司: 浙江千克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 吳斌林

1.一種禽畜糞便發(fā)酵菌劑的篩選方法，其主要包括菌種獲得和菌種篩選，

其菌種獲得的步驟如下：

步驟1、選取落葉覆蓋富含腐殖質(zhì)的土壤表面區(qū)域，撥開落葉表面，在其區(qū)域內(nèi)挖深度25-35cm，長(zhǎng)度55-65cm，寬度25-35cm的小坑，裝入塑料盆，再將新鮮豬糞傾倒入塑料盆中，坑口用塑料薄膜密封，在塑料薄膜處撒上枯枝或落葉，富集6-8天，形成豬糞混合液；

步驟2、步驟1后，稱取8-12g豬糞混合液加入85-95mL無菌水，振蕩25-35min，得到豬糞懸液；

步驟3、步驟2后，對(duì)振蕩均勻后的豬糞懸液進(jìn)行不同梯度稀釋，得到不同梯度稀釋的豬糞溶液；

步驟4、步驟3后，吸取各個(gè)稀釋濃度的豬糞溶液200μL分別涂布在高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏瓊脂培養(yǎng)基上，置于25-30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60-72h，最后選擇形態(tài)不同且長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的菌落進(jìn)行分離純化形成單菌落。

其菌種篩選的步驟如下：

步驟1、將菌種獲得中的步驟4分離得到的單菌落接種到氨選擇培養(yǎng)基瓊脂平板或搖瓶?jī)?nèi)，利用氨氣的菌株均會(huì)長(zhǎng)菌或渾濁，與不長(zhǎng)菌、空白組存在明顯的差異，挑選出能夠利用氨水作為唯一氮源生長(zhǎng)的菌株；

步驟2、將步驟1中篩選出的菌株以10％的接種量接種后放置在20-30℃環(huán)境中，以150r/min搖床培養(yǎng)6-8天，培養(yǎng)完成后根據(jù)氨氮的降解率公式計(jì)算氨氮降解率；

步驟3、將菌落獲得中的步驟4分離得到的單菌落按5％的接種量接種于豬糞混合液中分離菌株，將得到的菌株放入搖床培養(yǎng)，搖床溫度設(shè)置為25-35℃，轉(zhuǎn)速110-130r/min，菌種對(duì)豬糞進(jìn)行分解14-16天后根據(jù)氣味惡臭程度評(píng)定等級(jí)；

步驟4、篩選出步驟2和步驟3中效果均較好的相同菌株；

步驟5、將步驟4中得到的相同菌株接種入裝有400g新鮮豬糞的大燒杯中，再在豬糞表面放入一只裝有20mL的吸收液，用于吸收釋放NH₃，用保鮮膜將杯口密封，置于50℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，釋放量按照凱氏滴定法進(jìn)行測(cè)定；

步驟6、步驟5中恒溫箱培養(yǎng)后，累積測(cè)定2-3周，比較出累積釋放量最小的菌株，將這種菌株作為發(fā)酵菌劑的原料。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽畜糞便發(fā)酵菌劑的篩選方法，其特征是：所述菌種獲得步驟3中的不同梯度稀釋為10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6中的任意一種或多種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽畜糞便發(fā)酵菌劑的篩選方法，其特征是：所述菌種獲得步驟4中的高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基的主要成分是可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、KNO3 1g、K2HPO4·3H2O 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、瓊脂20g、純化水1L。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽畜糞便發(fā)酵菌劑的篩選方法，其特征是：所述菌種獲得步驟4中的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基的主要成分是葡萄糖40g、酪蛋白胰酶消化物和動(dòng)物組織的胃酶消化物等量混合10g、氯霉素0.1g、瓊脂15g、純化水1L。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽畜糞便發(fā)酵菌劑的篩選方法，其特征是：所述菌種獲得步驟4中的沙氏瓊脂培養(yǎng)基的主要成分是牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、瓊脂20g、純化水1L。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽畜糞便發(fā)酵菌劑的篩選方法，其特征是：所述降解率公式為氨氮降解率(％)＝(初始氨氮濃度﹣殘余氨氮濃度)÷初始氨氮濃度×100％。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽畜糞便發(fā)酵菌劑的篩選方法，其特征是：所述菌種篩選步驟3中的豬糞混合液的制作方法為取新鮮豬糞若干，調(diào)節(jié)水分為55-65％，混勻后進(jìn)行過濾，選取若干錐形瓶，每個(gè)錐形瓶中裝入150ml的豬糞溶液密封保存。