[發(fā)明專利]一種雞ACE2真核表達重組質粒載體的構建、鑒定與表達方法

在審

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• 申請日: 2020-10-21
• 公開（公告）號: CN112501200A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設計）人: 紀曉霞;張源淑;王換換;李帥;李志強;曹西月
• 申請（專利權）人: 南京農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N9/48;C12N15/57;C12N15/66
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本發(fā)明公開了一種雞ACE2真核表達重組質粒載體的構建、鑒定與表達方法，包括構建ACE2真核表達載體，轉染CHO細胞，篩選穩(wěn)定表達的pcDNA.3.1(+)?ACE2細胞株，獲得具有生物學活性的ACE2蛋白并測定酶活。本發(fā)明具有：①快速：僅需要1小時②簡單：無需酶切③高效：陽性率達95％以上④無縫：不引入額外序列等優(yōu)點。ACE2具有抗炎、抗損傷、抗纖維化等機體保護功能，特別作為SARS?CoV和SARS?CoV?2主要功能性受體，具有保護肺損傷功能。目前缺乏生物活性的雞ACE2蛋白，限制了其生物學功能的研究。本發(fā)明為深入研究雞ACE2作為病毒受體在禽冠狀病毒感染中發(fā)揮的生物學功能及其分子機制，開發(fā)以ACE2為冠狀病毒靶向治療藥物奠定基礎。所以本發(fā)明無論是從基礎研究還是臨床運用的意義都是十分重大的。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種雞ACE2(Angiotensin converting enzyme2)真核表達重組質粒載體的構建、鑒定并獲得穩(wěn)定過表達ACE2基因的細胞株方法。

背景技術

血管緊張素轉換酶2(Angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是2000 年首次報道的一種單羧肽酶，作為腎素-血管緊張素系統系統的重要一員，在調節(jié)心血管、腎臟功能及腸道功能中發(fā)揮重要作用。2003年，研究發(fā)現 ACE2是急性嚴重呼吸系統綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)的主要功能性受體，具有介導SARS-CoV入侵和細胞融合等作用，研究證實ACE2基因的表達水平與SARS-CoV的進入及疾病的嚴重程度密切相關。2019年研究發(fā)現SARS-CoV-2可以使用除小鼠ACE2外的所有ACE2作為受體進入細胞內，與SARS-CoV一樣，以細胞受體ACE2來入侵感染細胞。

根據病毒溯源研究證明，SARS-CoV、SARS-CoV-2等冠狀病毒均以動物作為自然宿主或中間宿主，因此，對動物ACE2受體功能的研究有助于闡明該病毒的跨種感染機制。但目前，ACE2的研究主要集中在人、小鼠、大鼠、斑馬魚等多種哺乳動物及水生動物，包括家禽在內的其他動物的 ACE2生物學功能目前尚不清楚。

在本發(fā)明研究中，擬以白羽肉雞為研究對象，應用RT-PCR和基因克隆技術從白羽肉雞空腸組織擴增ACE2基因，以同源重組方式連接到真核表達載體pcDNA.3.1(+)，在CHO細胞中通過G418和單克隆篩選獲得穩(wěn)定表達pcDNA.3.1(+)-ACE2的細胞株，以獲得具有生物學活性的ACE2蛋白，為深入研究雞ACE2作為病毒受體在禽冠狀病毒感染中發(fā)揮的生物學功能及其分子機制，開發(fā)以ACE2為冠狀病毒靶向治療藥物奠定基礎。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種雞ACE2真核表達重組質粒載體 pcDNA3.1(+)-ACE2構建、鑒定與表達方法，目的在于：①用它作為運載工具，將目的基因ACE2轉移到宿主細胞中去；②利用它在宿主細胞內對目的基因ACE2進行大量的復制(稱為克隆)，為深入研究雞ACE2作為病毒受體在禽冠狀病毒感染中發(fā)揮的生物學功能及其分子機制，開發(fā)以ACE2為冠狀病毒靶向治療藥物奠定基礎。其具體技術方案為：

一種雞ACE2真核表達重組質粒載體的構建與鑒定方法，包括以下步驟：

S1、21日齡白羽肉雞，頸部放血處死后取心臟、肝臟、肺臟、腎臟、回腸、盲腸、空腸等，經生理鹽水漂洗后迅速放入液氮速凍。提取基因組 RNA，反轉錄為cDNA。設計ACE2的上下游引物用于ACE2全長基因擴增，并在ACE2基因片段兩側分別加入pcDNA3.1(+)載體同源臂及EcoRI 酶切位點，以cDNA為模板，擴增獲得ACE2基因全長。EcoRI酶切 pcDNA3.1(+)載體和ACE2 PCR產物，切膠回收目的片段，以同源重組方式將pcDNA3.1(+)載體和ACE2進行連接。經菌液PCR、酶切、測序驗證獲得質粒pcDNA3.1(+)-ACE2。