[發明專利]一種雞ACE2真核表達重組質粒載體的構建、鑒定與表達方法

在審

• 申請號: 202011135191.4
• 申請日: 2020-10-21
• 公開（公告）號: CN112501200A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 紀曉霞;張源淑;王換換;李帥;李志強;曹西月
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N9/48;C12N15/57;C12N15/66
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1.一種雞ACE2真核表達重組質粒載體的構建、鑒定與表達方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、雞ACE2基因PCR擴增及回收：采用雞空腸cDNA為模板，根據NCBI雞ACE2序列MK560199，按照引物設計原則設計PCR引物，并在上游引物起始密碼子ATG前加入pcDNA3.1(+)載體同源臂和EcoRI酶切位點，引物序列如SEQ ID NO.1所示；

步驟2、載體和目的片段的重組采用同源重組方式連接；

步驟3、菌落PCR、酶切和測序驗證pcDNA3.1(+)-ACE2真核表達質粒的構建結果；

步驟4、以脂質體方法轉染至CHO細胞，經G418初步篩選后再經單克隆進一步篩選，使重組質粒能在CHO細胞中穩定表達；

步驟5、RT-PCR、Western-blot、免疫熒光鑒定pcDNA3.1(+)-ACE2重組體表達結果；

步驟6、雙抗體夾心法測定ACE2活性蛋白的酶活性。

2.根據權利要求1所述的雞ACE2真核表達重組質粒載體的構建與鑒定方法，其特征在于，步驟1中，PCR擴增的反應條件：95℃預變性1min，95℃變性20s，59℃退火20s，72℃延伸1min15s，72℃徹底延伸5min，32個循環。

3.根據權利要求1所述的雞ACE2真核表達重組質粒載體的構建與鑒定方法，其特征在于，步驟2中，反應連接體系(20uL)：包括4uL pcDNA3.1(+)載體，1uL目的序列，1uL同源重組酶，4uL5×Buffer，三蒸水10uL于200uLEP管中，混勻后，50℃，連接10min。

4.根據權利要求1所述的雞ACE2真核表達重組質粒載體的構建、鑒定與表達方法，其特征在于，步驟4中，加G418篩選14d后確定G418最低致死濃度為800ug/mL。

5.根據權利要求1所述的雞ACE2真核表達重組質粒載體的構建、鑒定與表達方法，其特征在于，步驟4中，將CHO細胞分為空白組、轉染空質粒pcDNA3.1組以及轉染pcDNA3.1-ACE2組，吸取轉染混合液加入6孔板里，空白組不作任何處理，37℃，5％CO2培養6h后棄轉染混合液，PBS洗滌。再分別加入2mL DMEM/F12(含10％FBS)液，繼續培養。

6.根據權利要求1所述的雞ACE2真核表達重組質粒載體的構建、鑒定與表達方法，其特征在于，步驟5中，Western blot鑒定時，細胞蛋白提取步驟將篩選單克隆細胞的6孔板，PBS洗滌兩次，加入蛋白裂解液，裂解15min，用細胞刮板將細胞刮進EP管。4℃，12000g/min離心20min，上清液即為所提取的蛋白溶液。BCA法測蛋白濃度，并統一蛋白濃度至4mg/mL。

7.根據權利要求1所述的雞ACE2真核表達重組質粒載體的構建、鑒定與表達方法，其特征在于，步驟6中將分別轉染了空質粒pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-ACE2 CHO細胞以及空白對照細胞提取細胞蛋白，雙抗體夾心法測定ACE2活性蛋白酶活性。