[發(fā)明專利]一種能夠分離原位降解多環(huán)芳烴的功能微生物的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011134177.2
• 申請(qǐng)日: 2020-10-21
• 公開（公告）號(hào): CN112410223A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李繼兵;羅春玲;江龍飛;李軍;張干
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/02
• 分類號(hào): C12N1/02;C12Q1/689;C12Q1/04
• 代理公司: 深圳科潤(rùn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44724
• 代理人: 朱琳

本發(fā)明公開了一種能夠分離原位降解多環(huán)芳烴的功能微生物的方法。主要包括如下步驟：采用穩(wěn)定同位素探針技術(shù)對(duì)多環(huán)芳烴污染環(huán)境中的降解功能微生物進(jìn)行原位探查；然后篩選出功能微生物，根據(jù)其與可培養(yǎng)菌群的親緣關(guān)系，設(shè)置不同的培養(yǎng)基成分并控制培養(yǎng)條件對(duì)污染環(huán)境中的微生物進(jìn)行純培養(yǎng)分離；最后將DNA穩(wěn)定同位素探針探查結(jié)果與室內(nèi)培養(yǎng)分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)比，確證所分離的菌株是否為原位參與污染物降解的功能微生物。綜上，本發(fā)明通過使用DNA穩(wěn)定性同位素探針能夠精確的分離和鑒定具有原位降解多環(huán)芳烴功能的微生物類群，對(duì)于分離和改良土壤中的原位微生物進(jìn)行多環(huán)芳烴污染場(chǎng)地的修復(fù)提供了經(jīng)濟(jì)、可行的技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種能夠分離原位降解多環(huán)芳烴的功能微生物的方法。

背景技術(shù)

隨著現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，工業(yè)廢水造成的污染日益嚴(yán)重。工業(yè)廢水中通常存在多種持久性有機(jī)污染物，如多環(huán)芳烴(PAHs)等。生物修復(fù)是一種費(fèi)用低廉、環(huán)境友好的PAHs污染修復(fù)方式，微生物可以降解環(huán)境中的PAHs從而達(dá)到修復(fù)的目的。為了探索PAHs在環(huán)境中的歸宿，一些基于培養(yǎng)的鑒定方法能夠識(shí)別和分離能夠單獨(dú)降解它們的微生物。至今，已經(jīng)分離出許多能降解PAHs的功能微生物，這種依賴培養(yǎng)的方法為確定降解菌種類、功能基因及代謝特征提供了線索。然而，在現(xiàn)實(shí)生境中，只有少數(shù)污染物功能降解菌可以被分離出來；并且，分離得到的功能微生物能否在自然生境中發(fā)揮作用仍然是值得懷疑的。由于自然環(huán)境中存在的大多數(shù)微生物是不可被培養(yǎng)的，該方法大大低估了原核微生物的多樣性，不能解釋在自然環(huán)境中微生物群落內(nèi)個(gè)體之間復(fù)雜的相互作用，同時(shí)也不能反映污染環(huán)境中功能微生物對(duì)污染物降解的真實(shí)情況。因此，很難利用實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)來揭示土著微生物的生態(tài)功能。相反，利用不可培養(yǎng)法可以不需要通過實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)來評(píng)估功能微生物的代謝反應(yīng)，并直接將它們的特性與自然生境中的功能聯(lián)系起來。

穩(wěn)定同位素探針(SIP)技術(shù)能夠?qū)⒎€(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)和分子生物學(xué)手段如高通量測(cè)序等相結(jié)合，通過向環(huán)境樣品中加入穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的目標(biāo)化合物(¹³C或¹⁵N)，運(yùn)用分子生物學(xué)手段對(duì)被穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的生物標(biāo)志物(如DNA、RNA等)進(jìn)行分析，可以確定環(huán)境樣品中的具有降解功能的微生物，特別是環(huán)境中不可培養(yǎng)的微生物。該技術(shù)可以跳過分離培養(yǎng)這一要求，直接將微生物群落和功能相聯(lián)系。盡管DNA-SIP技術(shù)已在土壤、海水等自然環(huán)境中成功鑒定出了多種降解PAHs的菌種，但是很少有研究人員通過分離培養(yǎng)方式成功地將其分離出來，因此難以解析功能微生物的遺傳信息和代謝信息。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種使用穩(wěn)定同位素探針技術(shù)將不依賴培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)和基于培養(yǎng)的分離方法結(jié)合起來分離原位降解PAHs的功能微生物的方法，以填補(bǔ)相關(guān)的研究空白。

本發(fā)明所述的一種能夠分離原位降解多環(huán)芳烴的功能微生物的方法，具體包括以下步驟：

(1)樣品采集；

(2)分別基于¹³C的DNA穩(wěn)定性同位素探針(DNA-SIP)技術(shù)對(duì)多環(huán)芳烴污染環(huán)境中的具有降解多環(huán)芳烴功能的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，同時(shí)使用¹²C-多環(huán)芳烴作為對(duì)照；

(3)利用超高速離心機(jī)對(duì)¹³C-多環(huán)芳烴培育組和對(duì)照組的微生物總DNA進(jìn)行離心分層；

(4)分別對(duì)¹³C重層DNA和對(duì)照組DNA進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增和高通量測(cè)序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定具有降解多環(huán)芳烴功能的微生物類群。

(5)根據(jù)篩選到的功能菌群與可培養(yǎng)物種的親緣關(guān)系，設(shè)置不同的培養(yǎng)基成分(C/N源等)，控制培養(yǎng)條件(pH、溫度、鹽度等)對(duì)污染環(huán)境中的微生物進(jìn)行分離；

(6)將DNA-SIP探查結(jié)果與室內(nèi)培養(yǎng)分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)照，確證所分離的菌株是否為原位參與污染物降解的功能微生物。