[發(fā)明專利]一種能夠分離原位降解多環(huán)芳烴的功能微生物的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011134177.2
• 申請(qǐng)日: 2020-10-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112410223A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李繼兵;羅春玲;江龍飛;李軍;張干
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/02
• 分類號(hào): C12N1/02;C12Q1/689;C12Q1/04
• 代理公司: 深圳科潤(rùn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44724
• 代理人: 朱琳

1.一種能夠分離原位降解多環(huán)芳烴的功能微生物的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)樣品采集；

(2)分別基于¹³C的DNA穩(wěn)定性同位素探針技術(shù)對(duì)多環(huán)芳烴污染環(huán)境中的具有降解多環(huán)芳烴功能的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，同時(shí)使用¹²C-多環(huán)芳烴作為對(duì)照；

(3)利用超高速離心機(jī)對(duì)¹³C-多環(huán)芳烴培育組和對(duì)照組的微生物總DNA進(jìn)行離心分層；

(4)分別對(duì)¹³C重層DNA和對(duì)照組DNA進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增和高通量測(cè)序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定具有降解多環(huán)芳烴功能的微生物類群。

(5)根據(jù)篩選到的功能菌群與可培養(yǎng)物種的親緣關(guān)系，設(shè)置不同的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件對(duì)污染環(huán)境中的微生物進(jìn)行分離；

(6)將DNA-SIP探查結(jié)果與室內(nèi)培養(yǎng)分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)照，確證所分離的菌株是否為原位參與污染物降解的功能微生物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原位降解多環(huán)芳烴的功能微生物的方法，其特征在于：步驟(1)中所述的樣品的類型為土壤、水體或者污泥等的任意一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原位降解多環(huán)芳烴的功能微生物的方法，其特征在于：步驟(2)中所述的多環(huán)芳烴為菲、萘、蒽和芘的任意一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原位降解多環(huán)芳烴的功能微生物的方法，其特征在于：步驟(3)中所述的DNA量為5μg DNA，DNA溶液為Tris-EDTA(TE，pH 8.0)/氯化銫溶液；通過(guò)添加適量TE或者TE/氯化銫溶液使其折

光度達(dá)到1.4020；超速離心的條件為：在20℃下超速離心48h，轉(zhuǎn)速為178000g；離心完后，用分層裝置將DNA溶液分14層。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原位降解多環(huán)芳烴的功能微生物的方法，其特征在于：步驟(4)中所述的¹³C組相比¹²C組的優(yōu)勢(shì)物種篩選方法為：秩和檢驗(yàn)和線性判別分析。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原位降解多環(huán)芳烴的功能微生物的方法，其特征在于：步驟(5)中所述的篩選到的功能微生物的16S rRNA基因全長(zhǎng)序列與可培養(yǎng)物種的最低相似度的閾值為95％。