[發明專利]巨噬細胞分離用組合試劑及其應用

有效

• 申請號: 202011133521.6
• 申請日: 2020-10-21
• 公開（公告）號: CN112239745B
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 張瀚文;張萊;丁鑫;彭聰;楊亞青;柏惠;陳希辰;陳琪
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

1.一種巨噬細胞分離用組合試劑，其特征在于組成為：心臟消化液A（A液）: 0.02g-0.05g Ⅱ型膠原酶，0.01g Ⅳ型膠原酶，0.02g-0.05g BSA加入50mL PBS緩沖液中；緩沖液B（B液）: 無鈣鎂HBSS緩沖液中加入1 wt.%-3wt.%的血清。

2.根據權利要求1所述巨噬細胞分離用組合試劑，其特征在于具體組成為：心臟消化液A（A液）: 0.03g Ⅱ型膠原酶，0.01g Ⅳ型膠原酶， 0.03g BSA加入50mL PBS緩沖液中；緩沖液B（B液）: 無鈣鎂HBSS緩沖液中加入2wt.%的血清。

3.權利要求1或2所述巨噬細胞分離用組合試劑的應用，其特征在于：將小鼠進行麻醉，麻醉后將小鼠心臟灌流，當小鼠心臟中的血液清除后將小鼠心臟取出放入B液中，將心臟組織修剪為1mm³的組織塊，修剪完畢后用 PBS緩沖液沖洗，沖洗完成后將小鼠心臟裝入10 mLEP管中，加入A液進行消化；消化結束后將心臟組織消化液使用300 g離心5分鐘，離心結束后棄上清，使用3 mL PBS將沉淀重懸，依次加入1 mL去碎片試劑與4 mL PBS緩沖液，300 g離心5分鐘, 所述去碎片試劑為Debris Removal Solution；離心結束后將帶有細胞碎片的懸濁液棄去，加入500 μL C液將沉淀重懸，并加入避光的1.5 mL EP管中，所述C液為0.03gⅡ型膠原酶加入50mL PBS緩沖液中；向細胞懸液中加入CD45、CD11b、F4/80以及死活細胞染料的流式抗體，在4℃轉盤上旋轉孵育抗體30分鐘，抗體孵育結束時加入1 mL C液后300 g離心5分鐘，使用PBS緩沖液重懸細胞清洗后300 g離心5分鐘，離心結束后棄去PBS，使用300μL B液對細胞進行重懸后加入流式管中進行流式細胞術分選巨噬細胞。

4.根據權利要求3所述巨噬細胞分離用組合試劑的應用，其特征在于：所述消化方法為向10 mL EP管中加入2 mL A液在37℃恒溫搖床中使用150轉速進行心臟組織消化；首次消化20分鐘后將消化液吸出經70 μm濾網過濾后加入置于冰上的15 mL離心管中；接下來向剩余組織中加入2 mL A液，37℃恒溫搖床消化10分鐘后吸出消化液經濾網過濾并加入上述離心管中，此步驟重復4次。