[發(fā)明專利]AroG的突變體及其在產(chǎn)氨基酸基因工程菌中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011129162.7
• 申請日: 2020-10-21
• 公開（公告）號: CN112266892B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張大偉;丁冬芹;柏丹陽;朱亞如
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/22;C12R1/19
• 代理公司: 北京商專永信知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11400
• 代理人: 歐陽石文

本發(fā)明公開了一種3?脫氧?α?阿拉伯庚酮糖酸?7?磷酸合酶AroG的突變體和調(diào)控因子RpoS的失活在產(chǎn)色氨酸菌株的構(gòu)建中的應(yīng)用。利用本發(fā)明獲得的基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵，可以獲得L?色氨酸的有效積累，能夠明顯提高其產(chǎn)量，具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和微生物領(lǐng)域，具體涉及AroG的突變體和調(diào)控因子RpoS的失活在產(chǎn)色氨酸的基因工程菌的構(gòu)建中的應(yīng)用，以及使用其發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

L-色氨酸作為人體內(nèi)的一種必需氨基酸，可以合成色素、5-羥基色胺、吲哚等重要的生物活性物質(zhì)，于醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用。目前，世界市場色氨酸的年需求量在萬噸以上，并以每年10％的速度增長。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，L-色氨酸廣泛應(yīng)用于氨基酸注射液、必需氨基酸藥品及水解蛋白質(zhì)的添加劑等。L-色氨酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物5-羥色胺，具有抗抑郁癥、提高睡眠質(zhì)量、抗高血壓及鎮(zhèn)痛作用。作為食品添加劑，L-色氨酸可以強(qiáng)化機(jī)體對植物蛋白的利用效率。在飼料中添加L-色氨酸，可以調(diào)節(jié)飼料中氨基酸的平衡，促進(jìn)家禽家畜的生長。

L-色氨酸的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法由于存在工藝復(fù)雜、產(chǎn)品成分復(fù)雜等原因，已逐漸被淘汰。而酶轉(zhuǎn)化法和微生物轉(zhuǎn)化法雖然已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化，但仍然存在原料昂貴、低轉(zhuǎn)化率等問題。通過葡萄糖等廉價原料來生產(chǎn)L-色氨酸的微生物發(fā)酵法是最早開發(fā)的L-色氨酸生產(chǎn)方式，但這種方法在很長的一段時期內(nèi)都無法實現(xiàn)工業(yè)化。究其原因，主要是在早起的研究中，研究者單一依靠傳統(tǒng)的化學(xué)或物理誘變方式選育L-色氨酸生產(chǎn)菌株，而經(jīng)過多輪的化學(xué)或物理誘變以后，很難確認(rèn)誘變過程中次級突變對菌株的影響，背景相對不清晰，進(jìn)而阻礙了菌種的進(jìn)一步改良。90年代以來，隨著DNA重組技術(shù)的快速發(fā)展，特別是代謝工程育種方式的興起，研究者逐漸選育出一批高產(chǎn)的L-色氨酸生產(chǎn)菌株，大幅提高了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸的效率，使其成為工業(yè)上主要的L-色氨酸生產(chǎn)方法。

近年來，隨著代謝工程、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和合成生物學(xué)的發(fā)展，人們通過分析代謝途徑，過量表達(dá)內(nèi)源基因或引入外源基因，消除競爭支路，成功構(gòu)建了合成特定目標(biāo)化合物并用于工業(yè)化生產(chǎn)的工程菌株。目前代謝工程在微生物合成氨基酸、有機(jī)酸、萜類化合物、聚羥基脂肪酸酯、生物燃料等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。大腸桿菌因其易于培養(yǎng)、遺傳背景清楚、遺傳操作簡便等優(yōu)點被大規(guī)模應(yīng)用于代謝工程改造用于合成各種有價值的化合物。

由于具有原料廉價、產(chǎn)物純度高、易提取等優(yōu)點，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸受到了越來越多的關(guān)注。隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程手段改造L-色氨酸合成途徑逐步發(fā)展起來。在不涉及化學(xué)誘變的情況下，趙志軍等運用代謝工程的研究策略，在不產(chǎn)L-色氨酸的E.coli W3110的基礎(chǔ)上，通過一系列的基因操作，使L-色氨酸的產(chǎn)量提高至17.7g/L(趙志軍.L-色氨酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建及代謝調(diào)控研究[D].無錫:江南大學(xué),2011.)。2017年，Chen等通過基因工程純理性改造的方法得到高產(chǎn)L-色氨酸菌株S028，通過發(fā)酵61h，L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)到了40.3g/L(Chen L et al.,Applied microbiology andbiotechnology,2017,101(2):559-568.)。而在1993年，Syoji Azuma等在發(fā)酵培養(yǎng)時添加pluronic L-61使L-色氨酸結(jié)晶，從而使L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)到了54.5g/L(Azuma S et al.,Applied Microbiology and Biotechnology,1993,39(4-5):471-476.)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于通過基因工程的方法對細(xì)菌尤其大腸桿菌中氨基酸相關(guān)代謝途徑基因進(jìn)行改造，從而獲得色氨酸生產(chǎn)菌株。

本發(fā)明的目的在于通過基因工程的方法對細(xì)菌(尤其大腸桿菌)的氨基酸相關(guān)代謝途徑基因進(jìn)行改造，從而獲得提高色氨酸產(chǎn)量的生產(chǎn)菌株。