[發明專利]利用YPB肽段抑制乳腺癌細胞增殖及腫瘤生長的方法和應用

有效

• 申請號: 202011128751.3
• 申請日: 2020-10-20
• 公開（公告）號: CN112239753B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 隋廣超;易誠;史金銘;李當當
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/70;A61K38/45;A61P35/00
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 岳泉清

1.一種YPB肽段，其序列為P-P-R-K-K-K-R-K-H-R-L-W-A-A-H-C-R-K-I-Q-L-K-K-D-G-S-S。

2.如權利要求1所述的YPB肽段在制備用于抑制乳腺癌細胞增殖或乳腺癌腫瘤生長的藥物中的應用，其特征在于通過YPB肽段與TAT和GGG合成，再標記上帶有熒光的FITC，得到FITC-TAT-GGG-YPB多肽；所述FITC-TAT-GGG-YPB多肽用于阻遏YY1和EZH2的結合。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述FITC-TAT-GGG-YPB多肽的序列為FITC-YGRKKRRQRRR-GGG-PPRKKKRKHRLWAAHCRKIQLKKDGSS。

4.如權利要求2中所述的YPB肽段的篩選及所述的FITC-TAT-GGG-YPB多肽的合成的方法，其特征在于該方法按以下步驟進行：

一、利用大腸桿菌表達His×6-YY1蛋白并進行純化；將EZH2功能區域分為4個片段，分別為Mut1：第1-251位氨基酸、Mut2：第252-384位氨基酸、Mut3：第385-604位氨基酸和Mut4：第604-746位氨基酸；構建GST-融合蛋白，并利用大腸桿菌進行蛋白表達和純化，得到純化后的GST-EZH2-Mut1、Mut2、Mut3和Mut4蛋白；

二、通過胺類偶合法將純化后的His×6-YY1蛋白偶聯到偶聯用芯片上，然后利用生物大分子互作儀分別測定純化后的GST-EZH2-Mut1、Mut2、Mut3和Mut4蛋白與His×6-YY1蛋白的結合程度，經過篩選，得到EZH2上一段負責與YY1的結合序列，將這一段序列命名為YPB肽段，其序列為P-P-R-K-K-K-R-K-H-R-L-W-A-A-H-C-R-K-I-Q-L-K-K-D-G-S-S；最后將YPB肽段與TAT和GGG合成，再標記上帶有熒光的FITC，得到FITC-TAT-GGG-YPB多肽；所述FITC-TAT-GGG-YPB多肽的序列為FITC-YGRKKRRQRRR-GGG-PPRKKKRKHRLWAAHCRKIQLKKDGSS。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟一中所述利用大腸桿菌表達His×6-YY1蛋白并進行純化的步驟如下：

(1)將YY1連接到pHis×6的原核表達載體上，構建得到pHis×6-YY1表達載體；將pHis×6-YY1表達載體轉入到大腸桿菌BL21 Tuners菌株內，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培養基中，在37℃的搖床中以220rpm的轉速過夜培養；將過夜培養后的菌液按1：50的比例加入到含有50μg/mL卡那霉素的LB培養基中，在37℃下培養2h～3h；

(2)將步驟(1)培養后的菌液降至16℃，加入濃度為0.2mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在16℃下繼續培養6h～8h或過夜；將菌液在4,000×g、4℃下離心20min，收集細菌，然后用25mL的緩沖液I重懸，緩沖液I由20mM Tris·HCl、200mM NaCl、1mM DTT和pH7.5、1×蛋白酶抑制劑組成；將裝有菌液的離心管在冰水的環境下進行超聲波處理，每處理30s間歇1min，直至菌體完全裂解；用20,000×g在4℃下離心30min，保留上清液，將上清液與1mL帶有鎳的樹脂混合，在4℃下滾動結合2h，然后將樹脂裝入層析柱，先用20mM的咪唑洗滌層析柱兩次、每次10mL，然后用40mM的咪唑洗滌層析柱兩次、每次10mL，再用200mM的咪唑洗脫層析柱10次、每次200μL，得到含有His×6-YY1的洗脫樣品；

(3)將含有His×6-YY1的洗脫樣品合并，在4℃條件下進行透析，每隔5小時更換一次透析液，共更換三次透析液，透析液由1.5M NaCl、0.05M Tris-HCl和1mM DTT組成，pH為7.5；將透析后的樣品分裝后凍存于-80℃下。