[發(fā)明專利]基于PCR反應(yīng)的多核苷酸擴(kuò)增方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011125057.6
• 申請日: 2020-10-20
• 公開（公告）號: CN112266949A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 范小英;常蕾
• 申請（專利權(quán)）人: 生物島實驗室
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6869;C12Q1/6883
• 代理公司: 北京睿陽聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11758
• 代理人: 張穎;郭奧博

本發(fā)明提供了一種基于PCR反應(yīng)的多核苷酸擴(kuò)增方法，所述方法包括對待擴(kuò)增樣品進(jìn)行冷凍處理的步驟。所述的基于PCR反應(yīng)的多核苷酸擴(kuò)增方法可用于單細(xì)胞基因組的測序中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于多核苷酸擴(kuò)增領(lǐng)域，具體地涉及基于PCR反應(yīng)的多核苷酸擴(kuò)增。

背景技術(shù)

單細(xì)胞全基因組測序是單細(xì)胞研究中最重要最常用的技術(shù)之一，能揭示腫瘤等稀有臨床樣品中的細(xì)胞異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)基因組的基因拷貝數(shù)變異、小片段插入或缺失、單核苷酸突變及結(jié)構(gòu)變異，評估基因組不穩(wěn)定性。在癌癥發(fā)展過程中能夠更加精確地挖掘出病理組織樣本中的隱藏信息，具有廣泛的應(yīng)用。

單細(xì)胞甲基化組測序是讀取基因組上DNA甲基化修飾的分布信息。DNA甲基化多發(fā)生于CpG二核苷酸序列上，而CpG富集區(qū)域多位于基因的啟動子區(qū)域，一般會導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄受到抑制。DNA甲基化水平異常與眾多疾病相關(guān)，在臨床疾病的檢測分析上應(yīng)用廣泛。

以上兩種單細(xì)胞測序技術(shù)的實施均有賴于有效的基因組擴(kuò)增。然而，單細(xì)胞的基因組起始量低，許多變異信息都僅有一個拷貝，為了滿足二代和三代測序儀的測序需要，增加變異檢測重復(fù)性，需要先對基因組進(jìn)行擴(kuò)增。有效的全基因組擴(kuò)增需要滿足以下特點：一、擴(kuò)增產(chǎn)率高，穩(wěn)定性強(qiáng)；二、基因組覆蓋率高；三、均勻無偏好性；四、擴(kuò)增錯誤率低，避免引入假陽性變異。目前已有的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)包括單純基于PCR擴(kuò)增的DOP-PCR技術(shù)，多重置換擴(kuò)增(MDA)技術(shù)，多重退火和基于環(huán)的擴(kuò)增循環(huán)(MALBAC)技術(shù)，通過轉(zhuǎn)座子插入進(jìn)行線性擴(kuò)增的LIANTI技術(shù)，以及過轉(zhuǎn)座子插入進(jìn)行長片段擴(kuò)增匹配三代測序平臺的Smile-seq技術(shù)。其中，MALBAC技術(shù)是目前使用最廣泛的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)，Smile-seq是最新的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)。對于單細(xì)胞甲基化組測序常用的方法為PBAT測序，該方法使用先對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化之后再進(jìn)行基因組擴(kuò)增。

現(xiàn)有的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)率有限并具有一定程度的擴(kuò)增偏好性，限制了測序得到的基因組覆蓋度和相應(yīng)甲基化修飾位點的數(shù)量，難以獲得單細(xì)胞全面的基因組信息。對于稀有細(xì)胞的基因組測定，可能丟失一些重要的單基因位點變異、結(jié)構(gòu)變異和修飾變異信息。目前尚無一種簡單通用的方法可以改善這一問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種基于PCR反應(yīng)的多核苷酸擴(kuò)增方法，所述方法包括對待擴(kuò)增樣品進(jìn)行冷凍處理的步驟。所述方法適于各種基于PCR反應(yīng)進(jìn)行多核苷酸擴(kuò)增的方法，尤其是少量細(xì)胞或單細(xì)胞的全基因組或甲基化組測序的方法，可以提高多核苷酸擴(kuò)增的產(chǎn)率，尤其是可以有效提高基于PCR反應(yīng)的單細(xì)胞基因組或甲基化組擴(kuò)增技術(shù)的產(chǎn)率，測序所得的單細(xì)胞全基因組序列的基因組覆蓋度和單細(xì)胞甲基化組的甲基化修飾位點數(shù)量。

第一方面，本發(fā)明提供了一種基于PCR反應(yīng)的多核苷酸擴(kuò)增方法，所述方法包括對待擴(kuò)增樣品進(jìn)行冷凍處理的步驟。

在一些實施方案中，所述方法包括在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前將待擴(kuò)增樣品在-60℃至-90℃的溫度下冷凍2天-3個月的時間的步驟。

優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品在-70℃至-90℃的溫度下進(jìn)行冷凍。

優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品在-75℃至-90℃的溫度下進(jìn)行冷凍。

優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品在-80℃至-85℃的溫度下進(jìn)行冷凍。

優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品在-80℃的溫度下進(jìn)行冷凍。

優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品冷凍2天-3個月的時間。

優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品冷凍2天-1個月的時間。

優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品冷凍2天-20天的時間。

優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品冷凍2天-10天的時間。

優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品冷凍2天-7天的時間。