[發(fā)明專利]基于PCR反應(yīng)的多核苷酸擴(kuò)增方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011125057.6
• 申請(qǐng)日: 2020-10-20
• 公開（公告）號(hào): CN112266949A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范小英;常蕾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 生物島實(shí)驗(yàn)室
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686;C12Q1/6869;C12Q1/6883
• 代理公司: 北京睿陽(yáng)聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11758
• 代理人: 張穎;郭奧博

1.一種基于PCR反應(yīng)的多核苷酸擴(kuò)增方法，所述方法包括對(duì)待擴(kuò)增樣品進(jìn)行冷凍處理的步驟，以提高多核苷酸擴(kuò)增的產(chǎn)率和/或降低多核苷酸擴(kuò)增的偏好性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前將待擴(kuò)增樣品在-60℃至-90℃的溫度下冷凍2天-3個(gè)月的時(shí)間的步驟；

優(yōu)選地，在-70℃至-90℃的溫度下進(jìn)行冷凍；優(yōu)選地，在-75℃至-90℃的溫度下進(jìn)行冷凍；優(yōu)選地，在-80℃至-85℃的溫度下進(jìn)行冷凍；優(yōu)選地，在-80℃的溫度下進(jìn)行冷凍；和/或

優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品冷凍2天-3個(gè)月的時(shí)間；優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品冷凍2天-1個(gè)月的時(shí)間；優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品冷凍2天-20天的時(shí)間；優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品冷凍2天-10天的時(shí)間；優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品冷凍2天-7天的時(shí)間；優(yōu)選地，將待擴(kuò)增樣品冷凍7天。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述基于PCR反應(yīng)的多核苷酸擴(kuò)增方法是基于PCR反應(yīng)的細(xì)胞多核苷酸擴(kuò)增方法；優(yōu)選地，所述基于PCR反應(yīng)的細(xì)胞多核苷酸擴(kuò)增方法是基于PCR反應(yīng)的少量細(xì)胞或單細(xì)胞多核苷酸擴(kuò)增方法；優(yōu)選地，所述基于PCR反應(yīng)的多核苷酸擴(kuò)增方法是基于PCR反應(yīng)的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增方法；優(yōu)選地，所述單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增方法還包括甲基化轉(zhuǎn)化的全基因組擴(kuò)增方法。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述基于PCR反應(yīng)的細(xì)胞多核苷酸擴(kuò)增方法包括以下步驟：

(1)用細(xì)胞裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理獲得細(xì)胞裂解物；

(2)使細(xì)胞裂解物中的蛋白酶失活后，進(jìn)行冷凍處理獲得待擴(kuò)增樣品；和

(3)對(duì)步驟(2)獲得的待擴(kuò)增樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述基于PCR反應(yīng)的多核苷酸擴(kuò)增方法為基于PCR反應(yīng)的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增；優(yōu)選地，所述單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增方法還包括甲基化轉(zhuǎn)化的全基因組擴(kuò)增方法；優(yōu)選地，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前將單細(xì)胞裂解液在-70℃至-90℃的溫度下進(jìn)行冷凍；優(yōu)選地，將單細(xì)胞裂解液在-75℃至-90℃的溫度下進(jìn)行冷凍；優(yōu)選地，將單細(xì)胞裂解液在-80℃至-85℃的溫度下進(jìn)行冷凍；優(yōu)選地，將單細(xì)胞裂解液在-80℃的溫度下進(jìn)行冷凍；和/或

優(yōu)選地，將單細(xì)胞裂解液冷凍2天-3個(gè)月的時(shí)間；優(yōu)選地，將單細(xì)胞裂解液冷凍2天-1個(gè)月的時(shí)間；優(yōu)選地，將單細(xì)胞裂解液冷凍2天-20天的時(shí)間；優(yōu)選地，將單細(xì)胞裂解液冷凍2天-10天的時(shí)間；優(yōu)選地，將單細(xì)胞裂解液冷凍2天-7天的時(shí)間，優(yōu)選地，將單細(xì)胞裂解液冷凍7天。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述基于PCR反應(yīng)的單細(xì)胞多核苷酸擴(kuò)增方法選自Smile-seq單細(xì)胞全基因組測(cè)序，MALBAC單細(xì)胞全基因組測(cè)序以及PBAT單細(xì)胞甲基化組測(cè)序。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述細(xì)胞裂解液含有選自如下的洗滌劑：十二烷基硫酸鈉，月桂基SDS，SDS C12，TRITON X-100，TRITON X-114，NP-40，TWEEN-20，TWEEN-80，辛基葡糖苷，辛硫基葡糖苷，3-((3-膽酰胺基丙基)二甲氨基)-1-丙磺酸鹽和十二烷基硫酸鋰；和/或

所述細(xì)胞裂解液含有選自如下的蛋白酶：絲氨酸蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶型蛋白酶，優(yōu)選蛋白酶K、brofasin；和/或

所述用細(xì)胞裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理的時(shí)間為10分鐘至20分鐘，20分鐘至30分鐘，30分鐘至1小時(shí)，1小時(shí)至3小時(shí)，3小時(shí)至6小時(shí)，6小時(shí)至9小時(shí)，9小時(shí)至12小時(shí)，12小時(shí)至15小時(shí)，15小時(shí)至18小時(shí)，18小時(shí)至21小時(shí)，或21小時(shí)至24小時(shí)；和/或

所述步驟(1)在50-75℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行溫育，優(yōu)選地在55-65℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行溫育。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法在提高多核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)率和/或在降低多核苷酸擴(kuò)增偏好性中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述多核苷酸擴(kuò)增為單細(xì)胞基因組或甲基化組擴(kuò)增。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法在基因組或甲基化組測(cè)序或分析中的應(yīng)用，

優(yōu)選地，所述基因組或甲基化組測(cè)序?yàn)閱渭?xì)胞基因組或甲基化組測(cè)序，；

優(yōu)選地，所述的基于PCR反應(yīng)的多核苷酸擴(kuò)增方法用于選自如下的分析：CGH，SNP分型，STR分型，SNV分析，CNV定量或SSCP分析；

優(yōu)選地，所述分析選自體細(xì)胞基因分型，產(chǎn)前篩查，腫瘤細(xì)胞基因組的異質(zhì)性檢測(cè)，刑偵現(xiàn)場(chǎng)痕量取證，和微生物單細(xì)胞變異檢測(cè)，

優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞基因組的異質(zhì)性檢測(cè)選自檢測(cè)腫瘤細(xì)胞基因組異質(zhì)狀態(tài)，表觀遺傳特性，細(xì)胞空間動(dòng)態(tài)，以及腫瘤微環(huán)境；

優(yōu)選地，所述產(chǎn)前篩查選自體外受精的植入前遺傳學(xué)診斷和單生殖細(xì)胞測(cè)序；

優(yōu)選地，所述分析為追蹤造血干細(xì)胞的分化。