[發明專利]一種快速高效的構建二代測序文庫的試劑盒

在審

• 申請號: 202011124075.2
• 申請日: 2020-10-20
• 公開（公告）號: CN112251821A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發明（設計）人: 曾志鵬;張鵬;邢寬;謝珍;何志健;何貴倫;安雪茹
• 申請（專利權）人: 南京實踐醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6806
• 代理公司: 南京瑞華騰知識產權代理事務所(普通合伙) 32368
• 代理人: 錢麗

本發明公開了一種快速高效的構建二代測序文庫的試劑盒，包括R1、R2和R3，R1包括DNA片段化末端修復加尾緩沖液、DNA片段化酶和末端修復加尾酶，R2包括連接緩沖液、連接酶和接頭，R3包括擴增酶、USER酶、通用引物和index引物。該試劑盒采用序列非特異性的核酸酶，可以在DNA上隨機打斷；在片段化、末端修復和加尾中添加非離子型去污劑做為增強劑，促進加尾酶的活性，使更多的末端修復片段加上A堿基，提高了片段的利用率；接頭使用U型接頭，減少了接頭二聚體的產生，使更多的接頭用于連接DNA片段，提高了文庫的轉化率。

技術領域

本發明屬于高通量測序技術領域，具體涉及一種快速高效的構建二代測序文庫的試劑盒。

背景技術

二代測序，又稱其為下一代測序技術(nextgeneration sequencing,NGS)，是對傳統測序(Sanger測序)一次劃時代的革命性的改變，一次測序可對幾十萬到幾百萬條DNA分子序列進行測定，同時二代測序使得對一個物種的轉錄組或基因組進行全面分析成為可能。NGS技術可以用來對任何一種生物的DNA(或RNA)進行測序，提供有價值的遺傳信息，作為一種高度可擴展的技術，二代測序可以應用于特定目標區域或整個基因組測序，幫助研究人員調查和發現，并更好地了解健康和疾病。

在核酸樣本放入測序儀測序前，通常需要對核酸樣品進行一系列的處理，包括核酸分子片段化、末端修復和序列兩端添加特異性的標簽和接頭，這一流程被稱為文庫構建，也叫建庫過程，而NGS建庫試劑盒通常提供用來完成從核酸片段修復到添加接頭過程的試劑組合。

目前，DNA文庫構建采用的流程通常是將超聲打斷或酶切處理后的片段化DNA序列依次進行末端修復、純化、3’端加A、純化、連接接頭、純化、文庫擴增和純化(見圖1)，整個過程耗時較長，對純化試劑消耗也比較多，每一次純化都或多或少的會損失樣本，整體文庫構建流程成本較高。

對于微量DNA樣本，高建庫轉化效率是提高測序檢測中對低頻變異分析效率的關鍵參數之一。針對微量DNA樣本(＜50ng)，有專利報道，目前常用的NEB、KAPAbiosystems和Illumina的建庫試劑盒的建庫轉化效率偏低，如其中KAPAbiosystems的KAPA hyper建庫試劑盒對于25ng 170bp的DNA片段的建庫轉化效率為2.21％-8.84％，對于50ng 170bp的DNA片段的建庫轉化效率為4.43％-8.84％。

因此，仍需要對現有技術進行改進，以改善現有的建庫流程長、成本高且建庫轉化率較低的缺陷。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速高效的構建二代測序文庫的試劑盒，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種快速高效的構建二代測序文庫的試劑盒，包括R1、R2和R3；

所述R1包括DNA片段化末端修復加尾緩沖液、DNA片段化酶和末端修復加尾酶；

所述R2包括連接緩沖液、連接酶和接頭；

所述R3包括擴增酶、USER酶、通用引物和index引物。

優選的是，所述DNA片段化末端修復加尾緩沖液包括10-50mM Tris-HCl、10-50mMMgCl₂、1-10mM DTT、20-100μM dNTP、0.2-1.0mM dATP、20-80mM NaCl、0.1-1mg/ml BSA、體積比0.1％-0.5％TritonX-100，體積比0.1％-1％Enhance。

上述任一方案中優選的是，所述Enhance可以是Twen20、NP40其中的一種或兩種的組合。

上述任一方案中優選的是，所述DNA片段化酶是非特異性核酸酶和T7Endonuclease I，所述非特異性核酸酶為嗜鹽弧菌Vvn(Vibrio Vulnificus)核酸酶。