[發明專利]一種海棲熱袍菌纖維寡糖轉運蛋白、其編碼基因及應用

有效

• 申請號: 202011123907.9
• 申請日: 2020-10-20
• 公開（公告）號: CN112239489B
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 湯宏赤;閉德武;郭媛;龐浩;劉藝;林麗華;周冰清
• 申請（專利權）人: 廣西科學院
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C12N15/31;C12N15/70;C12P19/14;C12P19/12;C12P19/04;C12P19/00
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 張換君

本發明公開了一種海棲熱袍菌纖維寡糖轉運蛋白、其編碼基因及應用，屬于生物技術領域，本發明通過基因工程手段構建E.coli Rosetta(DE3)/pET?Tma?cbtA菌株，本發明的海棲熱袍菌纖維寡糖轉運蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；其編碼基因的DNA序列如SEQ ID NO：2所示，本發明通過將海棲熱袍菌纖維寡糖轉運蛋白基因轉入感受態目的菌株并進行誘導表達培養，成功構建了高效表達海棲熱袍菌纖維寡糖轉運蛋白的工程菌株，并通過熱力學實驗證明了其能夠高效結合纖維寡糖，尤其是纖維五糖，為產業上進一步利用纖維素提供了工具。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種海棲熱袍菌纖維寡糖轉運蛋白、其編碼基因及應用。

背景技術

隨著化石能源的日趨枯竭以及人們對環境污染、能源危機等問題關注度的提高，尋找清潔的可再生能源成為當前的發明熱點。木質纖維素是由多種有機高分子化合物組成的具有高結晶度和聚合度的復合體，主要由纖維素、半纖維素和木質素通過共價鍵和非共價鍵相互連接形成，因其儲量豐富、成本低廉、清潔環保而受到各國科學家的青睞。

纖維素酶，包含外切-1,4-β-D-葡聚糖酶(exo-β-glμcanases,CBH)、內切-1,4-β-D-葡聚糖酶(endo-β-glμcanases,EG)、β-葡萄糖苷酶(endo-β-glμcosidases,GE)，可以將纖維素、半纖維素水解為單糖，其中外切-1,4-β-D-葡聚糖酶從纖維素的兩端水解結晶纖維素，釋放纖維二糖；內切-1,4-β-D-葡聚糖酶作用于纖維素內部的β-1,4糖苷鍵，隨機水解無定形纖維素，釋放各種纖維寡糖；β-葡萄糖苷酶也稱纖維二糖酶，主要水解纖維二糖、纖維寡糖，釋放葡萄糖。纖維二糖對外切-1,4-β-D-葡聚糖酶和內切-1,4-β-D-葡聚糖酶有抑制作用，而葡萄糖對β-葡萄糖苷酶有抑制作用，當水解液中的葡萄糖濃度升高時，纖維素的水解效率下降。因此，較低的木質纖維素酶解效率，較高的纖維素酶使用成本是制約木質纖維素這一可再生能源開發利用的瓶頸。

直接利用木質纖維素預處理液中的纖維寡糖是有效降低纖維素酶解和發酵成本，實現木質纖維素高效發酵轉化的途徑之一。但是，因為纖維素結構復雜以及纖維寡糖是大分子物質，不能以自由擴散等簡單的擴散方式通過細胞膜，必需通過轉運蛋白的協助。在目前的工業發酵微生物菌株中，沒有纖維寡糖轉運蛋白，不具有直接利用纖維寡糖進行發酵的能力。

發明內容

本發明公開了一種海棲熱袍菌纖維寡糖轉運蛋白、其編碼基因及應用，以解決上述現有技術存在的問題。

為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

本發明提供一種海棲熱袍菌纖維寡糖轉運蛋白，所述海棲熱袍菌纖維寡糖轉運蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明提供一種海棲熱袍菌纖維寡糖轉運蛋白的編碼基因，所述編碼基因的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明提供一種制備海棲熱袍菌纖維寡糖轉運蛋白的方法，具體包括如下步驟：

(1)pET-Tma-cbtA重組表達質粒的構建；

(2)重組底物結合蛋白的表達：將步驟(1)所述重組表達質粒轉化至大腸桿菌中，培養基因工程菌、誘導重組底物結合蛋白表達；

(3)純化步驟(2)所得的重組底物結合蛋白；

(4)將步驟(3)所得純化融合蛋白的洗脫液透析除鹽，得到純的重組底物結合蛋白。

進一步地，步驟(2)所述基因工程菌在含卡那霉素以及氯霉素的培養基中培養，采用的誘導劑為IPTG。

進一步地，所述基因工程菌的轉化方法為氯化鈣-氯化鎂法。

進一步地，所述純化重組底物結合蛋白的方法為親和層析法。