[發明專利]一株耐乙酸和甲酸的發酵菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 202011121007.0
• 申請日: 2020-10-19
• 公開（公告）號: CN112280700B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 湯岳琴;繆晡;李波;陳棟;吳婭婧
• 申請（專利權）人: 中國石油化工股份有限公司;中石化上海工程有限公司;四川大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/113;C12N15/90;C12R1/865
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 郎祺

本發明提供了一株耐乙酸和甲酸的發酵菌株及其構建方法，該釀酒酵母菌株為SEB15，分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏編號為CGMCC No.19588。本發明以具有優良的葡萄糖和木糖發酵能力的工業絮凝型釀酒酵母菌株為出發菌株，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術，將編碼目標轉錄因子的基因(HAA1)和功能基因(FDH1)的啟動子替換為在各典型抑制物脅迫下表達量較高且穩定的UBI4的啟動子獲得的發酵菌株SEB15。該發酵菌株耐受乙酸和甲酸能力較強，乙醇收率可以達到理論收率的84％，對于利用木質纖維素類原料生產燃料乙醇具有重要意義。

技術領域

本發明涉及發酵菌株的構建技術領域，尤其涉及一株耐乙酸和甲酸的發酵菌株及其構建方法。

背景技術

面對能源日益緊缺，環境污染問題日益嚴重的形勢，開發綠色、可再生的新型能源則變得更加緊迫。若將全球儲量大、可再生的木質纖維素類生物質通過發酵轉化為清潔能源燃料乙醇，將有助于緩解能源和環境危機。秸稈等木質纖維素類生物質的組織結構非常堅韌，必須經過預處理才能將其細胞結構破壞，釋放出其中的糖類物質。伴隨糖類物質的釋放，各類抑制物如弱酸類、呋喃類、以及酚類也釋放到水解液中。抑制物對乙醇發酵微生物釀酒酵母的生長和代謝會產生嚴重的脅迫作用，致使其繁殖速度慢，乙醇產率降低。因此構建能耐受各類抑制物的釀酒酵母菌株是實現纖維素燃料乙醇工業化生產的基礎。

不同來源的生物質及不同的預處理方式，使水解液中各類抑制物的組成和含量不同。弱酸類抑制物，乙酸和甲酸，普遍存在于各類水解液中。其中，乙酸主要是由半纖維素中的乙酰木聚糖生成，而甲酸則由呋喃醛類抑制物進一步衍生而成。一般情況下，水解液中甲酸的濃度低于乙酸，但由于其pKa值較低(甲酸：3.75，乙酸：4.75)，致使甲酸的抑制作用強于乙酸。鑒于弱酸類抑制物的普遍存在性及較高的脅迫濃度，構建耐受弱酸類抑制物的釀酒酵母菌株對于利用木質纖維素類原料生產燃料乙醇具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的缺陷，提供一株耐乙酸和甲酸的發酵菌株及其構建方法，以具有優良的葡萄糖和木糖發酵能力的工業絮凝型釀酒酵母菌株SEB5為出發菌株，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術，將編碼目標轉錄因子的基因(HAA1)和功能基因(FDH1)的啟動子替換為在各典型抑制物脅迫下表達量較高且穩定的UBI4的啟動子，以期達到高表達的目的。待獲得目標轉化子后，通過合成培養基批次發酵及秸稈水解液發酵評價轉化子的性能，獲得一株耐受乙酸和甲酸能力較強的菌株SEB15。

本發明為解決上述技術問題采用以下技術方案：

本發明的第一方面是提供一株耐乙酸和甲酸的發酵菌株，其為SEB15，分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏編號為CGMCC No.19588，保藏日期為2020年04月20日，保藏單位為中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

本發明的第二方面是提供上述耐乙酸和甲酸的發酵菌株的構建方法，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術將出發菌株SEB5的HAA1和FDH1基因的啟動子替換為UBI4啟動子，便構建了上述耐乙酸和甲酸的發酵菌株SEB15。

進一步地，上述構建方法具體包括如下步驟：

步驟一，修復片段(UBI4啟動子)的擴增：以菌株SEB5的基因組DNA為模板，通過PCR反應擴增UBI4啟動子并純化；

步驟二，構建雙鏈gRNA片段并擴增gRNA線性骨架：

確定HAA1和FDH1基因啟動子的PAM位點，構建雙鏈gRNA片段；

以pMEL13質粒為模板，引物為SEQ ID No.13～14，進行PCR擴增得到gRNA線性骨架并純化；

步驟三，連接上述gRNA片段和消化后的gRNA線性骨架，然后轉化，獲得gRNA質粒；