[發明專利]一株耐乙酸和甲酸的發酵菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 202011121007.0
• 申請日: 2020-10-19
• 公開（公告）號: CN112280700B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 湯岳琴;繆晡;李波;陳棟;吳婭婧
• 申請（專利權）人: 中國石油化工股份有限公司;中石化上海工程有限公司;四川大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/113;C12N15/90;C12R1/865
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 郎祺

1.一株耐乙酸和甲酸的發酵菌株，其特征在于，為SEB15，分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏編號為CGMCC No.19588，保藏日期為2020年04月20日，保藏單位為中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號；

所述發酵菌株的構建方法為：采用CRISPR/Cas9基因編輯技術將出發菌株SEB5的HAA1和FDH1基因的啟動子替換為UBI4啟動子，便構建了所述耐乙酸和甲酸的發酵菌株SEB15。

2.根據權利要求1所述的發酵菌株，其特征在于，所述構建方法包括如下步驟：

步驟一，修復片段的擴增：以菌株SEB5的基因組DNA為模板，通過PCR反應擴增所述UBI4啟動子并純化；

步驟二，構建雙鏈gRNA片段并擴增gRNA線性骨架：

確定所述HAA1和FDH1基因啟動子的PAM位點，構建所述雙鏈gRNA片段；

以pMEL13質粒為模板，引物為SEQ ID No.13～14，進行PCR擴增得到所述gRNA線性骨架并純化；

步驟三，連接所述gRNA片段和消化后的gRNA線性骨架，然后轉化，獲得gRNA質粒；

步驟四，將提取的Cas 9質粒轉入所述菌株SEB5中，然后進行涂布平板培養并篩選、PCR反應驗證獲得含Cas 9質粒的釀酒酵母；

步驟五，將所述gRNA質粒和修復片段轉入所述含Cas 9質粒的釀酒酵母，然后進行涂布平板培養并篩選、PCR反應驗證獲得耐乙酸和甲酸的發酵菌株SEB15菌落。

3.根據權利要求1所述的發酵菌株，其特征在于，所述構建方法還包括將所述發酵菌株SEB15菌落中的Cas9質粒和gRNA質粒去除。

4.根據權利要求2所述的發酵菌株，其特征在于，步驟一中所述PCR擴增采用的引物的序列為SEQ ID No.1～2。

5.根據權利要求2所述的發酵菌株，其特征在于，構建所述雙鏈gRNA片段所需的同源臂序列為：

tgRF：TGCGCATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCN20GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC；

tgR R：GTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACN20GATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAGTTTCGAACGCCGAAACATGCGCA。

6.根據權利要求2所述的發酵菌株，其特征在于，所述HAA1和FDH1基因啟動子的PAM位點的序列分別為SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。

7.根據權利要求2所述的發酵菌株，其特征在于，步驟三中所述gRNA片段和gRNA線性骨架通過Gibson連接方法進行連接；所述gRNA片段和gRNA線性骨架按質量比為5：1進行連接。

8.根據權利要求2所述的發酵菌株，其特征在于，步驟四中PCR反應采用的引物序列為SEQ ID No.11～12。

9.根據權利要求2所述的發酵菌株，其特征在于，步驟五中PCR反應采用的引物序列為SEQ ID No.5～6和SEQ ID No.9～10。